The Application of Differential Scanning Fluorimetry in Exploring Bisubstrate Binding to Protein Arginine <i>N</i> ‐Methyltransferase 1
Notice bibliographique
Résumé
Background Protein arginine N ‐methyltransferases (PRMTs) methylate polypeptide substrates using a methyl‐donor cofactor S ‐adenosyl‐L‐methionine (SAM). The binding mechanisms of both the cofactor and target substrates have been explored using transient and steady‐state kinetic experiments. However, many of these studies have found conflicting results due to the difficult and sometimes subjective interpretation of kinetic data. Therefore, a robust understanding of the PRMT bisubstrate mechanism can only be achieved through use of complementary structural and biophysical techniques. We hypothesize that thermal shift assays, which are widely used to monitor ligand‐receptor interactions in drug discovery processes, may be applied in a novel way to reveal order of bisubstrate binding to PRMTs. Methods We used differential scanning fluorimetry (DSF) to measure protein melting temperature ( T m ) changes in response to ligand binding. Protein unfolding was monitored using an environmentally sensitive dye SYPRO™ Orange, whose fluorescence increases when exposed to hydrophobic patches of unfolded protein. Cofactor analogues, peptide substrates, and an active site inhibitor were incubated with human PRMT1 to observe their individual and combined effects on enzyme stability; ligands which result in a higher T m interact with and stabilize the enzyme. Results We found that the cofactor analogues induce a positive shift in T m , indicating a stabilizing effect on PRMT1. Conversely, peptide substrates do not stabilize the enzyme and instead lead to a destabilizing, negative shift in T m . Together though, both cofactor and peptide substrate have an additive stabilizing effect on PRMT1. We also found that the active site inhibitor only interacts with PRMT1 in the presence of cofactor and causes a significant positive and stabilizing thermal shift. Conclusions We demonstrate for the first time that DSF can be used to explore the order of substrate binding to enzymes. Our results corroborate other structural, biophysical, and kinetic data which demonstrate that cofactor binding must precede target substrate binding for catalysis to occur. The enzyme:cofactor:substrate complex forms a stable structure that is conducive to methyl transfer. This technique is a valuable complement to kinetic experiments that will contribute to a sound understanding of enzyme kinetic mechanisms.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».