Caractérisation de la protection conférée aux cellules mammifères par des protéines recombinantes de blé lors de la cryoconservation

Les hépatocytes constituent un bon modèle physiologique en médicine et pharmacologie. Les îlots de Langherans sont également très utilisés dans ces domaines. De plus, ces deux éléments sont une alternative à la greffe d'un organe entier. Ces cellules sont isolées par chirurgie et le surplus est conservé grâce à la cryoconservation. Le cycle de gel et dégel peut causer des dommages qui sont évités ou diminués par l'utilisation d'agents de cryoconservation comme le diméthyle sulfoxyde (DMSO). L'inconvénient est qu'il est cytotoxique. L'objectif général du projet a été de développer de nouveaux agents de cryoconservation plus efficaces et moins toxiques afin d'améliorer les protocoles actuels de cryoconservation des hépatocytes et des cellules pancréatiques. Une alternative était d'utiliser des protéines de blé d'hiver Triticum aestivum L., qui sont associées avec la tolérance au gel. Un extrait brut de protéines de blé d'hiver a d'abord été testé comme agent de cryoconservation et il a permis de conserver efficacement des cellules de foie et une lignée cellulaire de pancréas. Afin d'identifier des protéines cryoactives individuelles, deux protéines déjà connues pour leurs rôles dans la tolérance au gel chez les plantes ont été testées comme agents de cryoconservation, seules ou en combinaison : la protéine de blé spécifique au froid WCS120, et la protéine de blé inhibitrice de la recristallisation de la glace TaIRI2. Par la suite, deux autres protéines ont été identifiées dans l'extrait brut de protéines de blé: l'énolase (TaENO) et la 2-Cys peroxirédoxine (TaBASl). Le premier objectif de ce projet était d'évaluer l'activité cryoprotectrice de TaENO et de TaBASl. Il a été possible de voir, par marquage à l'iodure de propidium, que TaENO et TaBASl permettent d'obtenir des taux de viabilité cellulaire supérieurs à ceux des cellules congelées avec du DMSO. Le maintien des fonctionnalités cellulaire a également été vérifié. La sécrétion d'urée a été évaluée chez les hépatocytes et les tests démontrent que les cellules congelées avec TaENO ou TaBASl sont plus fonctionnelles que celles congelées avec du DMSO. Concernant les cellules pancréatiques, l'évaluation de la sécrétion d'insuline induite par le glucose a permis de démontrer une meilleure efficacité des protéines. Lors de la congélation, du stress oxydatif peut être induit et pourrait causer la mort cellulaire. L'utilisation de sondes fluorescentes permettant de détecter certaines espèces réactives de l'oxygène et de l'azote a montré que TaENO et TaBASl n'induisent pas de stress aux cellules comparé au DMSO. Le second objectif a été de déterminer les mécanismes de protection des protéines. Dans un premier temps, nous avons déterminé, en marquant les protéines avec une sonde fluorescente Oregon Green et en les observant par microscopie confocale, que seules TaIRI-2 et TaENO sont internalisées lors de la cryoconservation. Ensuite, nous avons déterminé si les protéines inhibent la recristallisation des cristaux de glace et/ou modifient l'hystérèse thermique (TH). Aucune des protéines ne possède une activité TH et seules TaIRI-2 et TaENO inhibent la recristallisation. Enfin, le troisième objectif était de déterminer le type de mort induit lors de la cryoconservation et de comprendre comment les protéines protègent les cellules contre celle-ci. Les cellules ont été marquées avec la sonde Annexine-V. Le clivage de la protéine poly (ADP-ribose) polymérase (PARP) et l'activation des caspases exécutrices, caspase 3 et caspase 7, ont été détectés. Les hépatocytes subissent principalement l'apoptose lors de la cryoconservation avec le DMSO. En effet, le DMSO active les voies de la mitochondrie et du réticulum endoplasmique. Au contraire, les protéines de plantes atténuent l'activation d'au moins une de ces deux voies. En conclusion, cette recherche a permis le développement de nouveaux agents de cryoconservation plus efficaces que ceux déjà existants mais aussi la compréhension des mécanismes de protection des cellules par les protéines. De plus, la compréhension du processus de mort enclenché lors de la cryoconservation permettra d'améliorer les protocoles de conservation afin d'augmenter la disponibilité des cellules ainsi que leur qualité à des fins pharmacologiques ou médicales. Cette étude constitue une avancée importante dans le domaine de la cryobiologie. _____________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : cryoconservation, hépatocytes, cellules pancréatiques, protéines recombinantes de blé, apoptose, stress oxydatif

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