High Sensitivity Top‐down Proteomics: Coomassie for In‐gel Proteoform Detection Rivals MS‐based Peptide Detection
Notice bibliographique
Résumé
Several thousands of gene and splice variants, as well as post‐translational modifications, deepen the immense complexity of the human proteome. As these protein species or proteoforms define biological mechanisms in health and disease their direct analysis is critical, necessitating top‐down assessments in which the complete amino acid sequence and all modifications remain intact. Two‐dimensional gel electrophoresis (2DE) coupled with downstream mass spectrometry (MS) remains the most thorough and practical approach to Top‐down Discovery Proteomics, with resolving power to routinely analyze complex mixtures of intact proteoforms [1]. Increasing the quality and quantity of 2DE‐derived data largely relies on developing, optimising, and rigorously characterising methods for in‐gel total protein detection, providing quantitative, sensitive detection over a wide dynamic range while remaining practical [2]. Modified colloidal Coomassie Brilliant Blue (cCBB) staining meets these criteria [3, 4]; cCBB provides (sub)femtomole detection sensitivity for SDS‐PAGE and 2DE‐resolved intact proteoforms using either near‐infrared fluorescence detection (nIRFD) or densitometry [5]. This thus rivals the detection sensitivity of peptides by MS in ‘bottom‐up’ (i.e. shotgun) approaches to proteomics, which appear to provide larger protein catalogues but at the expense of critical data concerning proteoforms. Our ongoing work addresses a number of experimental variables which impact detection sensitivity in standard 1 mm‐thick polyacrylamide gels, providing a more realistic baseline measure of cCBB detection sensitivity and enhancing the overall practicality of 2DE for comprehensive proteome analysis. Here we showcase our most recent findings, including preliminary findings of further improvements to cCBB detection sensitivity when using ultra‐thin polyacrylamide gels. The novel ultra‐thin method utilised has been developed from minimally modified commercial equipment for vertical mini‐format gel electrophoresis and is thus accessible, affordable, and simple to implement in laboratories equipped for standard SDSPAGE and 2DE. The ultra‐thin gels do not require backing supports for handling, and potentially are compatible with commercial immobilised pH gradient strips routinely used for first dimension isoelectric focussing, further adding to the value and practicality of the method. Ultra‐thin 2DE may thus enable further mining of 2DE‐resolved proteomes, including the application of high resolution gel‐based proteomics in situations of limited sample quantity (e.g. biopsies, and perhaps single cells). Support or Funding Information NN and PSA received scholarship support from the WSU Molecular Medicine Research Group and the WSU School of Medicine, respectively. JRC notes the support of an anonymous private family foundation. This abstract is from the Experimental Biology 2018 Meeting. There is no full text article associated with this abstract published in The FASEB Journal .
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,006 | 0,005 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,002 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,002 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,002 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,001 | 0,002 |
| Communication savante | 0,004 | 0,002 |
| Science ouverte | 0,003 | 0,002 |
| Intégrité de la recherche | 0,002 | 0,003 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,004 | 0,005 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».