Creation of a real‐time fluorescence assay of the yeast PI4‐kinase, Pik1, to test the role of the PI/PC transfer protein Sec14 in the biosynthesis of phosphatidylinositol‐4‐phosphate
Notice bibliographique
Résumé
The yeast phosphatidylinositol-4 kinase Pik1 is critical for successful vesicular traffic from the trans-Golgi to the plasma membrane and endosomes. Although a soluble enzyme, the small myristoylated, Ca2+-binding, EF hand protein, frequenin (Frq1) facilitates its membrane localization. It has been suggested that the PI/PC transfer protein Sec14p assists Pik1 in locating its substrate by presenting membrane embedded PI to the kinase. In order to test this hypothesis, we have employed a fluorescence-based kinase assay (BellBrook Labs) that reports production of ADP following the lipid kinase's consumption of ATP. We used this kit to create a liposome-based real-time assay for the measurement of enzyme activity. The assay was developed and validated with a commercial lipid kinase to optimize signal from phospholipid vesicles prior to application to Pik1. A yeast expression system for Pik1 was created to preserve the stability of the 125 kDa enzyme by co-expressing both Frq1 and the heat shock protein, Cdc37, producing the Pik1-Frq1 complex with a removable 10xhistidine tag on Pik1. Following purification on metal affinity resin, our goal was to measure the purified kinase activity under different supporting lipid conditions and in the presence and absence of Sec14p, a protein hypothesized to act as a presenter of PI to the kinase enzyme. Support or Funding Information Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Discovery Grant (RGPIN-155187 and RGPIN-2017-06149) to JA Postulated mechanism for the substrate presentation model of Sec14 which partially extracts phosphatidylinositol from a lipid bilayer and raises it to the membrane-resident PI4-kinase Pik1. Postulated mechanism for the substrate presentation model of Sec14 which partially extracts phosphatidylinositol from a lipid bilayer and raises it to the membrane-resident PI4-kinase Pik1. This abstract is from the Experimental Biology 2019 Meeting. There is no full text article associated with this abstract published in The FASEB Journal.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,002 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,001 | 0,001 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,002 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».