Investigation of sequon engineering for improved O-glycosylation by the human polypeptide N-acetylgalactosaminyl transferase T2 isozyme and two orthologues
Notice bibliographique
Résumé
We have been developing bacterial expression systems for human mucin-type O-glycosylation on therapeutic proteins, which is initiated by the addition of α-linked GalNAc to serine or threonine residues by enzymes in the GT-27 family of glycosyltransferases. Substrate preference across different isoforms of this enzyme is influenced by isoform-specific amino acid sequences at the site of glycosylation, which we have exploited to engineer production of Core 1 glycan structures in bacteria on human therapeutic proteins. Using RP-HPLC with a novel phenyl bonded phase to resolve intact protein glycoforms, the effect of sequon mutation on O-glycosylation initiation was examined through in vitro modification of the naturally O-glycosylated human interferon α-2b, and a sequon engineered human growth hormone. As part of the development of our glycan engineering in the bacterial expression system we are surveying various orthologues of critical enzymes to ensure complete glycosylation. Here we present an in vitro enzyme kinetic profile of three related GT-27 orthologues on natural and engineered sequons in recombinant human interferon α2b and human growth hormone where we show a significant change in kinetic properties with the amino acid changes. It was found that optimizing the protein substrate amino acid sequence using Isoform Specific O-Glycosylation Prediction (ISOGlyP, http://isoglyp.utep.edu/index.php) resulted in a measurable increase in kcat/KM, thus improving glycosylation efficiency. We showed that the Drosophila orthologue showed superior activity with our human growth hormone designed sequons compared with the human enzyme.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».