A Comprehensive Guide for Assessing Covalent Inhibition in Enzymatic Assays Illustrated with Kinetic Simulations
Notice bibliographique
Résumé
Abstract Covalent inhibition has become more accepted in the past two decades, as illustrated by the clinical approval of several irreversible inhibitors designed to covalently modify their target. Elucidation of the structure‐activity relationship and potency of such inhibitors requires a detailed kinetic evaluation. Here, we elucidate the relationship between the experimental read‐out and the underlying inhibitor binding kinetics. Interactive kinetic simulation scripts are employed to highlight the effects of in vitro enzyme activity assay conditions and inhibitor binding mode, thereby showcasing which assumptions and corrections are crucial. Four stepwise protocols to assess the biochemical potency of (ir)reversible covalent enzyme inhibitors targeting a nucleophilic active site residue are included, with accompanying data analysis tailored to the covalent binding mode. Together, this will serve as a guide to make an educated decision regarding the most suitable method to assess covalent inhibition potency. © 2022 The Authors. Current Protocols published by Wiley Periodicals LLC. Basic Protocol I: Progress curve analysis of substrate association competition Basic Data Analysis Protocol 1A: Two‐step irreversible covalent inhibition Basic Data Analysis Protocol 1B: One‐step irreversible covalent inhibition Basic Data Analysis Protocol 1C: Two‐step reversible covalent inhibition Basic Data Analysis Protocol 1D: Two‐step irreversible covalent inhibition with substrate depletion Basic Protocol II: Incubation time–dependent potency IC50(t) Basic Data Analysis Protocol 2: Two‐step irreversible covalent inhibition Basic Protocol III: Preincubation time–dependent inhibition without dilution Basic Data Analysis Protocol 3: Preincubation time–dependent inhibition without dilution Basic Data Analysis Protocol 3Ai: Two‐step irreversible covalent inhibition Alternative Data Analysis Protocol 3Aii: Two‐step irreversible covalent inhibition Basic Data Analysis Protocol 3Bi: One‐step irreversible covalent inhibition Alternative Data Analysis Protocol 3Bii: One‐step irreversible covalent inhibition Basic Data Analysis Protocol 3C: Two‐step reversible covalent inhibition Basic Protocol IV: Preincubation time–dependent inhibition with dilution/competition Basic Data Analysis Protocol 4: Preincubation time–dependent inhibition with dilution Basic Data Analysis Protocol 4Ai: Two‐step irreversible covalent inhibition Alternative Data Analysis Protocol 4Aii: Two‐step irreversible covalent inhibition Basic Data Analysis Protocol 4Bi: One‐step irreversible covalent inhibition Alternative Data Analysis Protocol 4Bii: One‐step irreversible covalent inhibition
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,004 | 0,008 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,003 | 0,002 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,002 | 0,002 |
| Bibliométrie | 0,002 | 0,002 |
| Études des sciences et des technologies | 0,001 | 0,001 |
| Communication savante | 0,002 | 0,002 |
| Science ouverte | 0,004 | 0,002 |
| Intégrité de la recherche | 0,002 | 0,005 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,067 | 0,038 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».