Improved Nanopore full-length cDNA sequencing by PCR-suppression
Notice bibliographique
Résumé
Abstract Full-length transcript sequencing remains a main goal of RNA sequencing. However, even the application of long-read sequencing technologies such as Oxford Nanopore Technologies still fail to yield full-length transcript sequencing for a significant portion of sequenced reads. Since these technologies can sequence reads that are far longer than the longest known processed transcripts, the lack of efficiency to obtain full-length transcripts from good quality RNAs stems from library preparation inefficiency rather than the presence of degraded RNA molecules. It has previously been shown that addition of inverted terminal repeats in cDNA during reverse transcription followed by single-primer PCR creates a PCR suppression effect that prevents amplification of short molecules thus enriching the library for longer transcripts. We adapted this method for Nanopore cDNA library preparation and show that not only is PCR efficiency increased but gene body coverage is dramatically improved. The results show that implementation of this simple strategy will result in better quality full-length RNA sequencing data and make full-length transcript sequencing possible for most of sequenced reads. Contribution to the field Long-read RNA sequencing aims to sequence expressed transcripts in their entirety. However, this has remained a challenge, mainly due to inherent inefficiencies in cDNA library preparation. Herein, we provide a new Nanopore cDNA library preparation protocol, termed Panhandle, that improves the efficiency of cDNA PCR with yields 2 – 8 times the yields obtained with ordinary PCR. This is key, as this should in turn reflect in the possibility of lowering the number of PCR cycles needed to obtain ample sequencing material, which in turn could reduce PCR biases, PCR artifacts, turnaround time, reagents, and could increase general quality of the library. Further, transcripts generated using the Panhandle method show better gene body coverage and more accurate transcription start site mapping than regular methods. This represents an important step towards full-length cDNA sequencing by Nanopore.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».