Crystal digital RT-PCR for the detection and quantification of norovirus and hepatitis A virus RNA in frozen raspberries
Notice bibliographique
Résumé
Berries are important vehicles for norovirus (NoV) and hepatitis A virus (HAV) foodborne outbreaks. Sensitive and quantitative detection of these viruses in food samples currently relies on RT-qPCR, but remains challenging due to their low concentration and the presence of RT-qPCR inhibitors. Moreover, quantification requires a standard curve. In this study, crystal digital RT-PCR (RT-cdPCR) assays were adapted from RT-qPCR sets of primers and probe currently used in our diagnostic laboratory for the detection and precise quantification of norovirus genogroups I and II (NoV GI, GII) and hepatitis A virus (HAV) RNA in frozen raspberry samples. We selected assay conditions based on optimal separation of positive and negative droplets, and peak resolution. Using virus-specific in vitro RNA transcripts diluted in raspberry RNA extracts, we showed that all three RT-cdPCR assays were sensitive, and we estimated the 95 % detection limit at 9 copies per RT-cdPCR reaction for NoV GI, 3 for NoV GII, and 14 for HAV. Serial dilutions of the RNA transcripts showed excellent linearity over a range of four orders of magnitude. We achieved precise quantification (CV ≤ 35 %) of the RNA transcripts between runs down to 15-145 copies per reaction for NoV GI, <20 for NoV GII, and < 15 for HAV. The three RT-cdPCR assays also proved to be tolerant to inhibitors from frozen raspberries, although not as tolerant as the RT-qPCR assays in the case of NoV GI and HAV. We further evaluated the assays with inoculated frozen raspberry samples and compared their performance to that of the RT-qPCR assays. As compared to the corresponding RT-qPCR assays, the NoV GI and HAV RT-cdPCR assays showed a decreased qualitative sensitivity, while the NoV GII RT-cdPCR assay had an increased sensitivity. As for quantification, the NoV GI and NoV GII RT-cdPCR assays produced similar estimates of RNA copy number than their respective RT-qPCR assays, whereas for HAV, the RT-cdPCR assay produced lower estimates than the RT-qPCR assay. However, all the RT-cdPCR assays provided more precise quantitative measurements at low levels of contamination than the RT-qPCR assays. In conclusion, the potential of the RT-cdPCR assays in this study to detect viral RNA from frozen raspberries varied according to assay, but these RT-cdPCR assays should be considered for precise absolute quantification in difficult matrices such as frozen raspberries.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,003 | 0,004 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,001 | 0,001 |
| Communication savante | 0,002 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,002 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,004 | 0,002 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».