A monochromatically excitable green-red dual-fluorophore fusion incorporating a new large Stokes shift fluorescent protein
Notice bibliographique
Résumé
ABSTRACT Genetically encoded sensors enable quantitative imaging of analytes in live cells. State-of-the-art sensors are commonly constructed by combining ligand-binding domains with one or more sensitized fluorescent protein (FP) domains. Sensors based on a single FP are susceptible to artifacts caused by differing expression levels or sensor distribution in vivo . Hence, our lab developed dual-FP Matryoshka technology introduced by a single cassette that contains a stable large Stokes shift (LSS) reference FP nested within a reporter FP (cpEGFP), allowing simple construction of intensiometric sensors with the capacity for ratiometric quantification. The first-generation Green-Orange (GO) Matryoshka cassette established proof of concept but required custom optical setups to maximize achievable dynamic range. Here, we present a genetically encoded calcium sensor that employs optimized second-generation Green-Apple (GA) Matryoshka technology that incorporates a newly designed red LSSmApple fluorophore. LSSmApple provides improved excitation spectrum overlap with cpEGFP, allowing for monochromatic co-excitation with blue light. The exceptionally large Stokes shift of LSSmApple results in improved emission spectrum separation from cpEGFP, which minimizes fluorophore bleed-through and facilitates imaging using standard dichroics and red fluorescent protein (RFP) emission filters. We developed an image analysis pipeline for yeast ( Saccharomyces cerevisiae ) timelapse imaging that utilizes LSSmApple to segment and track cells for high-throughput quantitative analysis. In summary, we engineered a new fluorescent protein, constructed a genetically encoded calcium indicator (GA-MatryoshCaMP6s), and performed calcium imaging in yeast as a demonstration.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,001 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».