Doxycycline-inducible Expression of Proteins at Near-endogenous Levels in Mammalian Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System
Notice bibliographique
Résumé
The function of a protein within a cell critically depends on its interaction with other proteins as well as its subcellular localization. The expression of mutants of a particular protein that have selective perturbation of specific protein interaction motifs is a very useful strategy for resolving a protein's mechanism of action in a cellular process. In addition, expression of fluorescent protein fusions is a key strategy for determining the subcellular localization of a protein. These strategies require tight regulation to avoid potential alterations in protein interactions or localizations that can result from protein overexpression. Previous work led to the development of a Sleeping Beauty transposon system that allows doxycycline-inducible expression of protein mutants or fusions; titration of doxycycline allows expression of protein fusions or mutants at near endogenous levels. When used in combination with siRNA gene silencing, this strategy allows for knockdown-rescue experiments to assess the function of specific protein mutants. In this protocol, we describe the use of this Sleeping Beauty strategy for expression of eGFP fusion or mutant proteins in ARPE-19 and MDA-MB-231 cells. This includes design of expression plasmids, transfection, and selection to obtain stable engineered cells, as well as doxycycline treatment for controlled induction of protein expression, either alone or in combination with siRNA silencing for knockdown-rescue experiments. This strategy is advantageous as it allows rapid generation of stable cells for controlled protein expression, suitable for functional studies that require knockdown-rescue as well as various forms of live cell fluorescence imaging. Key features • Highly versatile doxycycline-inducible expression system that can be used in various mammalian cell lines. • Stable integration of transgene allows for sustained and stable expression. • Titration of doxycycline levels allows expression of transgene at near endogenous levels.
Récupéré en direct depuis OpenAlex et désinversé. Les résumés ne sont pas conservés dans cette base de données : les index inversés représentent 8,6 Go des 9,3 Go de texte de la base, et le serveur dispose de 13 Go libres.
Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction distillée sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Apprise à partir de 10 348 étiquettes directes de Codex et de 10 348 étiquettes directes de Gemma. Le mode candidate est l'union des têtes enseignantes seuillées; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont ni des étiquettes humaines ni des étiquettes directes de modèles de pointe.
Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule tête enseignante, pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».