Defining Interactomes of Wild‐Type Versus Misfolding Type I Collagen Variants in Osteogenesis Imperfecta
Notice bibliographique
Résumé
Osteogenesis imperfecta (OI), also known as “brittle bone disease”, is a clinically heterogeneous, heritable connective tissue disorder that occurs in approximately one out of every 15,000–20,000 births. Unfortunately, despite decades of research effort, there is currently no cure for OI. Treatment options are symptomatic and limited to orthopaedic care and the administration of antiresorptive bone drugs such as bisphosphonates that have deleterious side effects. Disrupted collagen‐I proteostasis caused by the production of mutant, misfolding collagen‐I strands is a key pathological mechanism underpinning OI. However, a detailed mechanistic understanding of the fundamental processes of wild‐type and mutant collagen‐I maturation is currently lacking. We created a new cellular platform, based on osteosarcoma Saos2 cells, for biochemical studies of collagen folding and misfolding. We prepared eight different Saos‐2 cell lines inducibly expressing either HA‐tagged wild‐type or mutant collagen‐I under control of the Tet‐On system . The collagen mutations introduced were Col1A1‐Gly247Ser, Col1A1‐Gly352Ser, Col1A1‐Gly883Ser, Col1A1‐Cys1299Trp, Col1A2‐Gly502Ser, and Col1A2‐Gly610Cys. The tetracycline‐inducible expression of HA‐tagged collagen‐I proteins was confirmed by Western blotting. Importantly, HA‐tagged collagen was found to be inserted into triple‐helical collagen‐I molecules. We next employed mass spectrometry‐based proteomics strategy to define the proteostasis network of wild‐type collagen‐I in Saos‐2 cells. Our proteomic data revealed about 120 different proteins, including all known collagen‐I interactors such as Hsp47, BIP, PDI, CRTAP and more that might play a role in collagen‐I proteostasis. We then used comparative and TMT‐assisted quantitative proteomics to establish the differential interactomes of wild‐type and OI‐causing collagen‐I variants. We identified several proteins that differently engage wild‐type and mutant collagen‐I, including proteins in the PDI and HSP40/70/90 families, and ER proteins involved in protein post‐translational modifications. Proteins identified as important factors are being knocked down with shRNA or overexpressed (both in the Saos‐2 system and in primary OI patient fibroblasts). Biochemical approaches, including Western blotting to evaluate both intra‐ and extra‐cellular levels of collagen‐I, radiolabeling to follow the extent of post‐translational modifications, and pulse‐chase experiments to determine the rates of secretion and degradation, are being used to validate their effects on mutant collagen‐I maturation. Our mechanistic findings in follow‐up studies are revealing new players in cellular collagen‐I folding and quality control that may play an important role in OI pathology. Support or Funding Information Funding from the Mallinckrodt Foundation, the Smith Family Foundation, the NIH/NIAMS (1R03AR067503), the Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ), and the Canadian Institute of Health Research (CIHR).
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».