Non-Viral RNA-Lipid Nanoparticles for High Efficiency Genome Editing of CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Advanced Cell and Gene Therapies
Notice bibliographique
Résumé
Background and Aims: The application of CRISPR-Cas9 gene editing in hematopoietic stem (HSC) and progenitor cells (HSPCs) has the potential to revolutionize the treatment of genetic blood disorders by correcting disease-causing mutations. Previously, we demonstrated the utility of a novel lipid nanoparticle (LNP) reagent for the multiplexed engineering of gene-edited CAR T cells, showing high cell viabilities, rapid onset editing, and potent CAR-mediated killing. In this current work, we demonstrate the capability of LNPs for the efficient and gentle delivery of genetic material to CD34+ HSPCs. The benefits of a non-viral LNP-mediated approach paves the way for the development of next generation gene therapy products in the HSC field. Methods: LNPs encapsulating S.p. Cas9 mRNA and CD33 or CD45 targeted guide RNA (sgRNA) were produced using the scalable NanoAssemblr® NxGen™ microfluidic platform technology ( Fig. 1A). The LNP composition was optimized for the gentle and efficient cargo delivery to HSC/HSPCs. Purified human CD34+ cells were cultured, stimulated, and treated by the direct addition of the RNA-LNPs. Various commercial cell sources were tested including mobilized peripheral blood and cord blood. Gene knockout and viability were assessed using flow cytometry, cell proliferation using an automated cell counter, and differentiation capacity by colony-forming unit (CFU) assays. Results: One-step addition of LNPs to CD34+ HSPCs resulted in 84 ± 6% CD33 and 81 ± 2% CD45 knockout efficiencies (n=6 CD34+ donors, Fig. 1B). After treatment, cells maintained on average 95 ± 3% absolute cell viability, compared to 99% viability of the untreated cells, Fig. 1C. Furthermore, LNP treated HSCs maintained excellent cell proliferation, with over >90% relative cell proliferation to the untreated controls. The CFU assays showed no significant change in relative lineage formation for both the RNA-LNPs and the empty LNP vehicle control ( Fig. 1D). Finally, LNP production was successfully scaled-up using microfluidics from discovery to pre-clinical scales. Conclusions: LNP-mediated CRISPR-Cas9 mRNA delivery is a promising approach for gene editing in HSPCs. The simple and gentle nature of LNP cell treatment allows for multiple genetic engineering steps for simultaneous expression and deletion of proteins for novel gene therapies. Furthermore, LNPs can be easily manufactured using microfluidics, enabling small-scale screening of RNA libraries and rapid scale-up for clinical translation.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».