Capillary Electrophoresis-Based Immobilized Enzyme Microreactor Utilizing Pepsin for Bottom-Up Proteomics
Notice bibliographique
Résumé
Abstract In this study, we introduced a novel method for pepsin immobilization through investigation into three different coupling reactions, aiming to simplify peptide mapping. We initially determined the optimal enzyme-to-substrate ratio to be 1:0.1 (mass:mass) for highest peptidic peak count via UV-detection. The study began with three coupling strategies, the triethoxysilylbutyraldehyde derivative, 4-triethoxysilylbutanoic acid (4-TESBA) approach proving most effective. The resultant coupled enzyme particles (CEPs) showcased robustness and fast digestion at varying temperatures. We streamlined the CEP wash procedure from our previous work, while maintaining the quality of digestions. The physical size of CEPs did not correlate to digestion efficiency, providing insights for potential cost-saving in enzyme utilization. Further optimization led to an immobilization efficiency of 50.8 ± 7.7% (SEM) as validated by Bradford’s assay. Adapting this method for in-situ immobilized enzyme microreactor (IMER) fabrication, we discovered that 4-TESBA could dual-serve by functionalizing the silica capillary’s inner wall while simultaneously acting as an enzyme coupler, plus being a safer alternative to 3-(Aminopropyl)triethoxysilane (APTES). A dipeptide was successfully fully cleaved, and a variety of proteins were digested with the IMER. The bovine serum albumin (BSA) digestion through the IMER, mirroring CEP digestion conditions, yielded a 33-40% primary sequence coverage per LC-MS/MS analysis in as short as 15 minutes. Our findings underscore the potential of our method in both CEP and IMER fabrication scenarios, paving the way for enhanced analysis and a reduction in enzyme usage, thereby contributing to more cost-effective and timely proteomic investigations.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».