Heterologous expression and purification of glutamate decarboxylase-1 from the model plant <i>Arabidopsis thaliana</i> : characterization of the enzyme’s <i>in vitro</i> truncation by thiol endopeptidase activity
Notice bibliographique
Résumé
ABSTRACT Plant glutamate decarboxylase (GAD) is a Ca 2+ -calmodulin activated cytosolic enzyme that produces γ-aminobutyrate (GABA) as the first committed step of the GABA shunt. This pathway circumvents the 2-oxoglutarate to succinate reactions of the mitochondrial tricarboxylic acid cycle. Our prior research established that in vivo phosphorylation of the root-specific AtGAD1 isozyme (AT5G17330) occurs at multiple N-terminal serine residues, following Pi resupply to Pi-starved cell cultures of the model plant Arabidopsis thaliana . The aim of the current investigation was to purify recombinant AtGAD1 following its expression in Escherichia coli to facilitate studies of the impact of site-specific phosphorylation on its kinetic properties. However, in vitro proteolytic truncation of a 5 kDa polypeptide from the C-terminus of 59 kDa AtGAD1 subunits occurred during its purification. Immunoblotting demonstrated that most protease inhibitors or cocktails that we tested were ineffective in suppressing partial AtGAD1 proteolysis during incubation of clarified extracts at 23 °C. Although the thiol modifiers N-ethylmaleimide or 2,2-dipyridyl disulfide negated AtGAD1 proteolysis, they also abolished its GAD activity. This indicates that an essential -SH group is needed for catalytic activity, and that AtGAD1 is susceptible to partial degradation either by an E. coli cysteine endopeptidase, or possibly via autoproteolytic activity. The inclusion of exogenous Ca 2+ /calmodulin in extraction and chromatography buffers facilitated the purification of non-proteolyzed AtGAD1 to a specific activity of 27 (µmol GABA produced/mg) at optimal pH 5.8, while exhibiting an approximate 3-fold activation by Ca 2+ /CaM at pH 7.3. By contrast, the purified partially proteolyzed His 6 -AtGAD1 was >40% less active at both pH values, and only activated 2-fold by Ca 2+ /CaM at pH 7.3. These results emphasize the need to diagnose and prevent unwanted proteolysis before conducting kinetic studies of purified regulatory enzymes.
Récupéré en direct depuis OpenAlex et désinversé. Les résumés ne sont pas conservés dans cette base de données : les index inversés représentent 8,6 Go des 9,3 Go de texte de la base, et le serveur dispose de 13 Go libres.
Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction distillée sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Apprise à partir de 10 348 étiquettes directes de Codex et de 10 348 étiquettes directes de Gemma. Le mode candidate est l'union des têtes enseignantes seuillées; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont ni des étiquettes humaines ni des étiquettes directes de modèles de pointe.
Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule tête enseignante, pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».