Indigo Formation as a Predictor of Substrate Promiscuity in Cytochrome P450 BM3 Libraries
Notice bibliographique
Résumé
Cytochrome P450 BM3 natively exhibits substrate promiscuity, mainly in hydroxylation and epoxidation reactions. Whereas directed evolution has broadened its scope of reactivity, screening for specific non-native enzymatic reactivity remains challenging, thereby limiting potential applications. In this study, we investigated the predictive potential of indigo production as an indicator of promiscuous hydroxylation in non-native aromatic compounds. Following site- saturation mutagenesis on 42 residues in the active-site region, we rapidly identified 97 previously unreported variants at 18 unique positions, significantly increasing the database of indigo-positive variants. From this expanded pool, we isolated 80 well-expressed indigo-positive variants and evaluated them alongside 46 well-expressed indigo-negative variants for their hydroxylation activity on the representative non-native aromatic compounds, anisole and naphthalene. We observed a strong correlation between indigo formation and aromatic compound hydroxylation, with 73-80% of indigo-positive variants hydroxylating these compounds, compared to 40-45% of indigo-negative variants. Notably, only indigo-positive variants showed greater than 3-fold higher activity than the wild-type P450 BM3. Furthermore, a positive correlation was obtained between promiscuous hydroxylation of anisole and naphthalene. The approach also allowed identification of new variants that hydroxylate a further aromatic compound, 4-phenyl-2-butanone, suggesting generality. Although we did not succeed in identifying the molecular basis underlying the indigo- positive phenotype, our findings demonstrate that indigo production is an effective screening tool, expediting the discovery of novel functional genes for promiscuous aromatic hydroxylation reactions. This method offers a cost-effective and efficient approach to identify and develop new biocatalysts, advancing the potential applications of P450 BM3 in scientific and industrial fields.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,001 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».