A yeast-based reverse genetics system to generate HCoV-OC43 reporter viruses encoding an eighth sgRNA
Notice bibliographique
Résumé
ABSTRACT Coronaviruses have large, positive-sense single-stranded RNA genomes that challenge conventional strategies for mutagenesis. Here, we report the development of a new reverse genetics system for the endemic human coronavirus (HCoV) OC43 that utilizes transformation-associated recombination (TAR) to assemble complete viral genomes from dsDNA genome fragments via homologous recombination in Saccharomyces cerevisiae . Following cDNA synthesis from HCoV-OC43 viral RNA, we used TAR to capture fragments of the HCoV-OC43 genome to store as sequence-validated dsDNA parts. We performed combinatorial assembly in yeast to obtain an intact dsDNA copy of the HCoV-OC43 genome sufficient to launch viral replication upon introduction into human cells, yielding the yeast assembled OC43 YA virus. We also expanded the OC43 YA genome by inserting an eighth body transcription regulatory sequence (B-TRS) and an mClover3-H2B reporter gene between the M and N genes, designed to allow the reporter protein to be translated from its own subgenomic mRNA. We thoroughly evaluated OC43 YA and the OC43-mClo YA reporter virus, and demonstrated comparable viral gene expression, fitness in cell culture, and susceptibility to antivirals, compared to their natural progenitor. In summary, this new HCoV-OC43 reverse genetics system provides a modular platform for mutagenesis and combinatorial assembly of HCoV-OC43 genomes, and demonstrates the feasibility of expanding the genome while avoiding disruption of native coding sequences. IMPORTANCE Human coronavirus OC43 (HCoV-OC43) is an endemic human coronavirus that typically causes relatively mild respiratory illnesses and displays seasonal patterns of infection. We developed a new system to assemble DNA copies of HCoV-OC43 genomes and generate recombinant viruses for research purposes. This system uses yeast, first to capture segments of DNA encompassing the entire RNA-based viral genome, and then to stitch them together into complete DNA genome copies that can be amplified in bacteria and introduced into human cells to initiate an infectious cycle, ultimately yielding recombinant viruses with comparable properties to their natural progenitors. We also devised a strategy to expand the viral genome, adding a gene for a reporter protein encoded by an additional eighth subgenomic mRNA. This yeast-based genome assembly system provides a modular platform for rapid mutagenesis and combinatorial assembly of HCoV-OC43 genomes and demonstrates the feasibility of expanding the genome.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».