Development of an on-chip fluorescence anisotropy immunoassay for human C-peptide secretion reveals a general roadmap for tracer optimization
Notice bibliographique
Résumé
ABSTRACT Fluorescence anisotropy immunoassays (FAIAs) are widely used to quantify the concentration of target proteins based on competition with a tracer in binding a monoclonal antibody. We recently designed an FAIA to measure mouse C-peptide secretion from living islets in a continuous-flow microfluidic device (InsC-chip). To develop an assay for human C-peptide, our initial selection of antibody-tracer pairings revealed the need to optimize both the dynamic range and the binding kinetics to measure the assay on-chip effectively. Here, we present strategies for developing an on-chip FAIA using two different monoclonal antibodies to achieve both a large dynamic range and high temporal resolution. The two monoclonal antibodies (Ab1 & Ab2) to human C-peptide initially showed low dynamic range and slow kinetics, preventing them from being used in an on-chip assay. To shorten the time-to-reach equilibrium for Ab1, we reengineered the tracer based on a comparison between the human and mouse C-peptide sequences, resulting in > 30-fold shorter time-to-reach equilibrium. To increase the relatively small dynamic range for Ab2, we used partial epitope mapping and targeted point mutations to increase the dynamic range by 45%. Finally, we validated both FAIAs by measuring depolarization-induced insulin secretion from individual hESC-islets in our InsC-chip. These strategies provide a general roadmap for developing FAIAs with high sensitivity and sufficiently fast kinetics to be measured in continuous-flow microfluidic devices.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,003 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,002 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,001 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,002 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».