Validation and Optimization of a Stable Isotope-Labeled Substrate Assay for Measuring AGAT Activity
Notice bibliographique
Résumé
L-arginine: glycine amidinotransferase (AGAT) gained academic interest as the rate-limiting enzyme in creatine biosynthesis and its role in the regulation of creatine homeostasis. Of clinical relevance is the diagnosis of patients with AGAT deficiency but also the potential role of AGAT as therapeutic target for the treatment of another creatine deficiency syndrome, guanidinoacetate N-methyltransferase (GAMT) deficiency. Applying a stable isotope-labeled substrate method, we utilized ARG 15N2 (ARG-δ2) and GLY 13C215N (GLY-δ3) to determine the rate of 1,2-13C2,15N3 guanidinoacetate (GAA-δ5) formation to assess AGAT activity in various mouse tissue samples and human-derived cells. Following modification and optimization of the assay, we analyzed AGAT activity in several mouse organs. The Km and Vmax of AGAT in mouse kidney for GLY-δ3 were 2.06 mM and 6.48 ± 0.26 pmol/min/mg kidney, and those for ARG-δ2, they were 2.67 mM and 2.17 ± 0.49 pmol/min/mg kidney, respectively. Our results showed that mouse kidneys had the highest levels of enzymatic activity, followed by brain and liver, with 4.6, 1.8, and 0.4 pmol/min/mg tissue, respectively. Both the heart and muscle had no detectable levels of AGAT activity. We noted that due to interference with arginase in the liver, performing the enzyme assay in liver homogenates required the addition of Nor-NOHA, an arginase inhibitor. In immortalized human cell lines, we found the highest levels of AGAT activity in RH30 cells, followed by HepaRG, HAP1, and HeLa cells. AGAT activity was readily detectable in lymphoblasts and leukocytes from healthy controls. In our assay, AGAT activity was not detectable in HEK293 cells, in human fibroblasts, and in the lymphoblasts of a patient with AGAT deficiency. Our results demonstrate that this enzyme assay is capable of accurately quantifying AGAT activity from both tissues and cells for diagnostic purposes and research.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,005 | 0,004 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,002 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,002 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,001 | 0,001 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,002 | 0,002 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».