Efficient Site‐Directed Mutagenesis Mediated by Primer Pairs with 3’‐Overhangs
Notice bibliographique
Résumé
Site-directed mutagenesis is an essential tool in molecular biology, protein engineering, plasmid engineering and synthetic biology. While the QuickChange method has been one of the most employed methods for site-directed mutagenesis, it is hindered by low efficiency and frequent introduction of unwanted mutations at the primer sites, raising the urgent need for new, more efficient, and reliable methods. Here, we present an optimized site-directed mutagenesis protocol that leverages partially complementary primer pairs with 3'-overhangs to improve mutagenesis efficiency and reduce error rates. Our method significantly enhances success rates, achieving an average efficiency of ∼50% with some instances approaching the ideal threshold of 100%, while also minimizing the time required for mutant generation. Typically, only 3 colonies need to be analyzed per mutagenesis reaction, and a skillful trainee can engineer 1 to 2 dozen mutant plasmids within a week. In addition, with an in-house protocol for preparing highly competent bacterial cells, we have further increased the reliability and cost-effectiveness of the method. Notably, such competent cells have been kept in a liquid nitrogen tank for >12 years with minimal loss of competency. Thus, this refined method offers a robust, efficient, and scalable solution for high-precision gene modification in vitro, with broad applications in protein and plasmid engineering. © 2025 The Author(s). Current Protocols published by Wiley Periodicals LLC. Basic Protocol 1: In vitro site-directed mutagenesis using an optimized primer design strategy Basic Protocol 2: Preparation of high-efficiency chemocompetent DH5α cells for transformation of mutagenized plasmid products Basic Protocol 3: Transformation of chemocompetent DH5α cells and obtaining bacterial colonies with correctly mutagenized plasmid products Alternate Protocol: Transformation if glycerol stocks are unavailable.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,004 | 0,003 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,003 | 0,004 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,003 | 0,002 |
| Bibliométrie | 0,002 | 0,002 |
| Études des sciences et des technologies | 0,001 | 0,001 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,003 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,002 | 0,005 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,016 | 0,023 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».