Fluorogenic oligonucleotide cleavage probes with a branched linker improve RNA detection
Notice bibliographique
Résumé
Fluorescent probe-based quantitative polymerase chain reaction (qPCR) is essential for DNA/RNA quantification widely used in research and clinical diagnostics. The performance of fluorogenic probes depends heavily on their design, particularly the identities of the fluorophore and quencher moieties, and the linkers used to attach them to oligonucleotides. Here we report a highly modular, three-way branched glycerol 'X' linker in fluorogenic TaqMan® type oligonucleotide probes for multiplexed, reverse transcription qPCR (RT-qPCR). The flexible 'X' linker served as an internal attachment point for various quenchers (BHQ1, BHQ2) in probes containing a variable fluorophore at the 5' end (Flu, Hex, Cy5, Cy5.5). A four-color RT-qPCR 'tetraplex' assay was thereby developed for distinguishing between RNA genomes from SARS-CoV-2, influenza A, and influenza B viruses in a single reaction. The 'X' linker exhibited superior performance with single-molecule detection limits approaching four copies, compared to an internal arabinoside-based (ara) linker strategy, demonstrating the presence of competing processes during primer extension, one where Taq exonuclease activity cleaves the fluorogenic X probe leading to productive fluorescence, and the second where the ara probe is displaced from the PCR template without cleavage. Together these results demonstrate the importance of linker structure selection in oligonucleotides for developing highly effective fluorogenic probes for qPCR.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,001 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,002 | 0,002 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».