Optimized Methods for Measuring Extracellular ATP from In Vitro Airway Epithelial Cell Cultures
Notice bibliographique
Résumé
Abstract Rationale: Extracellular adenosine triphosphate (eATP) is a neurotransmitter detectable in airway surface lining fluid. Patients with refractory chronic cough (RCC) demonstrate an exaggerated cough response to ATP inhalation, suggesting eATP plays a role in evoking cough. Abnormally high eATP concentrations in human airways have been found to correlate with COPD severity, asthma, and CF-associated neutrophilic inflammation, suggesting dysfunctional ATP release and/or metabolism in disease states. In vitro measurement of eATP in diverse lung cell types is typically performed in real-time via transient chemiluminescence reactions, limiting the potential for higher throughput or time-delayed experimental designs. This work presents methods for measuring eATP from in vitro cell cultures with high signal stability and resolution.Methods: Calu-3 bronchial epithelial cells and primary human bronchial epithelial cells (HBECs) were cultured under submerged monolayer conditions on tissue culture plastic or under air-liquid interface (ALI) conditions in Transwell™ inserts. The ATPlite™ Luminescence ATP Detection Assay System (Revvity) was used to measure eATP from cell culture media and apical wash samples. This kit is intended for measuring intracellular ATP using a lysis buffer containing ATP-stabilizing agents that irreversibly inhibit ATPases, maintaining a luminescence signal with a half-life over 5 hours. To measure only eATP while retaining the ATP-stabilizing benefits of the lysis buffer, we explored using centrifugation or syringe filters to remove cells and isolate eATP in collected samples. Characterizations were performed for luminescence assay sensitivity, stability of frozen samples, and effectiveness of cell removal via centrifugation or syringe filters. Concentrations of eATP in apical and basal compartments of ALI-differentiated primary HBECs were compared. Results: Luminescence signals were directly proportional to the ATP standard concentration with a minimum sensitivity of 0.61 nM ATP. Removing cells from samples via centrifugation yielded lower ATP signals than syringe filtered samples. Syringe filters with 0.22 and 0.45 µm pore sizes removed all cells from cell suspensions without inducing detectable ATP release. ATP release was 8.5× higher in the apical compartment of ALI-differentiated primary HBECs compared to the basolateral compartment. Apyrase, an ATP-degrading enzyme, demonstrated specificity of the eATP signal in these experiments. Conclusions: Our data describe a method that enables in vitro measurement of eATP with higher signal stability than typical transient luminescence-based assays and an apical preference for ATP secretion in human airway epithelial cells. Funding: This study was funded by a research grant to I.S. (McMaster University) from the Investigator Initiated Studies Program of Merck Inc.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,003 | 0,002 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,002 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,001 | 0,001 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,002 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,002 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,003 | 0,005 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».