Cost-effective production of <i>Escherichia coli</i> “GABase” for spectrophotometric determination of γ-aminobutyrate (GABA) levels or glutamate decarboxylase activity
Notice bibliographique
Résumé
Abstract γ-aminobutyrate (GABA) is a non-proteinogenic amino acid produced by glutamate decarboxylase (GAD) that functions as a vital neurotransmitter in animals, and as an important metabolite and signaling molecule in plants and microbes. “GABase” consists of a mixture of recombinant GABA transaminase (GABA-T) and succinic semialdehyde dehydrogenase (SSDH) that is widely used for spectrophotometric quantification of glutamate decarboxylase (GAD) activity or GABA levels in tissue extracts. Both can be conveniently monitored at 340 nm owing to the sequential conversion of GABA into succinate by GABA-T and SSDH, and concomitant reduction of NADP+ into NADPH by SSDH. Currently, these assays rely on commercially available GABase from Pseudomonas fluorescens. However, the excessive cost of commercial GABase prompted us to develop an inexpensive and rapid “DIY” method for producing GABase by cloning, expressing and purifying His6-tagged GABA-T and SSDH from Escherichia coli. We validated our in-house GABase preparation by comparing GAD activities and GABA levels of the model plant Arabidopsis thaliana with those obtained using commercial GABase. Both pET30a plasmids for expressing E. coli His6-GABA-T and His6-SSDH have been deposited into AddGene (www.addgene.com). Our protocols for producing and using recombinant E. coli GABase should be of interest to any researcher who studies eukaryotic or prokaryotic GABA and/or GAD activity.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,002 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,002 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,002 | 0,005 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».