Bioorthogonal Non-Canonical Amino Acid Tagging (BONCAT) to detect newly synthesized proteins in cells and their secretome
Notice bibliographique
Résumé
BACKGROUND: Cells respond to physiological or pathological stimuli by altering the composition of the proteins they produce. This adaptation includes changes to newly translated polypeptides that are destined for intracellular compartments or secretion. The secretome is relevant to cell physiology, as it promotes autocrine, paracrine, and endocrine signaling. These events control cell death, tissue repair, and other regenerative processes. Uncovering the changes in de novo protein synthesis under different growth conditions requires reliable methods to identify and quantify newly synthesized proteins. Bioorthogonal Noncanonical Amino Acid Tagging (BONCAT) can generate this information with high spatiotemporal resolution. METHODS: We developed a BONCAT-based protocol to characterize proteins synthesized de novo in mammalian cells. Cultured HeLa cells are used as a model system, as their cell physiology is particularly well understood. The current protocol employs L-azidohomoalanine as an L-methionine analog, which is incorporated into newly translated polypeptide chains. After the incubation period, cells and the growth medium, which contains the secretome, are processed separately. Specifically, proteins are alkylated, and L-azidohomoalanine is modified with a biotin affinity tag. Proteins are collected using a rapid precipitation method, which is compatible with the subsequent affinity purification of biotinylated polypeptides. The affinity-purified material can be used for diverse downstream applications, such as Western blotting. Our experiments illustrate the feasibility of different steps of the protocol. Moreover, we discuss potential bottlenecks of the procedure and provide solutions that address these obstacles. DISCUSSION: Our work demonstrates the power of a modified BONCAT protocol to study newly produced proteins in growing cells and their secretome. This method will be useful to examine the proteome and secretome changes that are linked to the altered performance of cells, tissues, and organs during aging, disease, or other challenging conditions.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction distillée sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Apprise à partir de 10 348 étiquettes directes de Codex et de 10 348 étiquettes directes de Gemma. Le mode candidate est l'union des têtes enseignantes seuillées; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont ni des étiquettes humaines ni des étiquettes directes de modèles de pointe.
Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule tête enseignante, pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».