Nonequilibrium Capillary Electrophoresis of Equilibrium Mixtures (NECEEM)-Enabled Mechanistic Analysis of Cooperative Binding: Application to C-Reactive Protein–SOMAmer Complexes
Notice bibliographique
Résumé
Understanding cooperative binding is essential for characterizing interactions between multimeric proteins and their ligands, because biological function often depends on binding stoichiometry or allosteric regulation. Detailed characterization of cooperativity, in turn, requires determination of the equilibrium dissociation constants for each binding step ( K d1, K d2,...). However, most experimental methods rely on ensemble-averaged signals that cannot resolve coexisting complexes, forcing stepwise constants to be inferred from model-dependent fits that cannot be validated with ensemble data alone. To date, direct (model-independent) determinations of these constants have been reported only with spectral-resolution techniques such as native MS and slow-exchange NMR; no physical-separation method has yet delivered K d1, K d2, etc. Here, we present a nonequilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures (NECEEM)-based approach that physically resolves and quantifies stoichiometric complexes formed at equilibrium. A protein and its ligand are pre-equilibrated in solution, and the resulting complexes of different stoichiometries are separated from one another and from free ligand according to their electrophoretic mobilities. Quantitative peak analysis yields the equilibrium fractions of each species, providing step-resolved thermodynamic data from which individual K d values are obtained directly, without global model fitting; their relative magnitudes reveal the presence and extent of cooperativity. As proof of concept, we studied the interaction between C-reactive protein (CRP), a homopentameric acute-phase protein of the innate immune system, and a slow off-rate modified aptamer (SOMAmer). The electropherograms resolved and quantified free ligand as well as 1:1 and 2:1 SOMAmer–CRP complexes, allowing determination of the 95% accuracy confidence intervals (ACI) for the first two dissociation constants: K d1 = 3.0–7.8 nM and K d2 = 41–160 nM, consistent with strong negative cooperativity. At high ligand-to-target ratios, 3:1 SOMAmer–CRP complex was also detected, but its peak could not be baseline-resolved, precluding reliable determination of K d3 . This study establishes NECEEM as the first solution-phase physical-separation method capable of directly quantifying stepwise affinities and dissecting cooperativity in multivalent systems.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».