Reshaping of a Glycoside Hydrolase Active Site through Expression-Compensated Droplet-Based Microfluidic Screening Provides Useful Tools for Glycomics
Notice bibliographique
Résumé
The glycosylation of proteins endows them with distinct biophysical properties and allows them to play fundamental roles in cellular communication. Much of our understanding of glycoproteins has derived from the ability to enzymatically manipulate glycan structures. In particular, selective cleavage of glycans from proteins simplifies the analysis of glycoproteins and the determination of structure-activity relationships. However, limited enzymatic tools are available for the study of mucin-type O-glycans. To address this, we carried out the directed evolution of a glycoside hydrolase to increase its ability to cleave the sialyl T-antigen, a ubiquitous O-glycan structure in humans. We employed ultrahigh-throughput droplet-based microfluidics to rapidly screen vast libraries of variants in pL-sized droplets, thus minimizing the quantities of complex substrate required. Furthermore, by use of fluorescent protein-fusion and ratiometric gating during droplet sorting we could account for varying expression levels and identify highly active hits that could have been overlooked due to lower expression levels. Within just two rounds of screening, we uncovered variants with 840-fold enhancements in activity and new specificities compared to those of the WT enzyme. This campaign highlights the versatility of glycoside hydrolases and provides a broadly applicable strategy to engineer enzymatic tools for glycomics through microfluidic screening.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction distillée sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Apprise à partir de 10 348 étiquettes directes de Codex et de 10 348 étiquettes directes de Gemma. Le mode candidate est l'union des têtes enseignantes seuillées; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont ni des étiquettes humaines ni des étiquettes directes de modèles de pointe.
Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,001 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule tête enseignante, pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».