B-174 Turning Polyclonal Antibodies into Monoclonals: A Proteomics-Driven Approach
Notice bibliographique
Résumé
Abstract Background Polyclonal antibodies (pAb), derived from immunized animals, are essential reagents used in antigen-specific experiments across diagnostics and research. However, pAb production faces challenges such as batch-to-batch variability, hindering research reproducibility and requires continued animal use and culling. One potential solution is determining the sequences of dominant antibody forms within a polyclonal mixture, enabling the development of recombinant monoclonal antibody mixtures. This approach allows for recombinant expression, replicating the binding characteristics of the original pAbs and promoting reproducibility in clinical research and laboratory medicine. Methods In this study, we employed a novel mass spectrometry-based method using the REpAb® polyclonal sequencing platform to sequence polyclonal antibodies directly from a purified protein mixture, completely de novo, without relying on prior sequence knowledge or databases. First, a purified polyclonal mixture was subjected to multi-enzyme digestion to generate shorter, overlapping peptides. Both middle-down and top-down mass spectrometry methods were then applied to analyze these peptides. The resulting data was de novo sequenced by tandem mass spectrometry (MS/MS), and the peptides were subsequently assembled into full-length antibody chains with correct pairing of the heavy and light antibody chains using machine learning-based bioinformatics. Protein lysates underwent analysis using an Orbitrap EclipseTM Series instrument (ThermoFisher Scientific, CA, US) coupled with the LC Evosep One (Evosep, Denmark). Results Following de novo sequencing of the polyclonal antibodies, chain assembly, and chain pairing, the dominant antibody forms within the pAb mixture were recombinantly expressed as monoclonal antibodies (mAbs) based on the derived sequences. The recombinant mAbs exhibited affinities in the mid-picomolar to low-nanomolar range and demonstrated comparable activity to the original polyclonal sample. Conclusion This study demonstrates the application of mass spectrometry and de novo protein sequencing technology to generate recombinant polyclonal antibody mixtures directly from a purified protein mixture. This approach enhances the application of polyclonal antibodies in research, laboratory, and diagnostic settings where reproducibility is essential. High affinity, antigen-specific antibodies were successfully captured and derived without the need for cell lines or nucleotide sequence data. By converting a polyclonal mixture into recombinant monoclonal forms, good antibody products can be immortalized and produced at a large scale, eliminating the irreproducibility issue inherent with pAbs.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,002 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,001 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,002 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,002 | 0,002 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».