A split luciferase system for studying coronavirus Mpro dimerization in vitro and in living cells
Notice bibliographique
Résumé
The main protease enzyme (M pro ) of coronaviruses cleaves the viral polyprotein into functional units essential for virus replication.Prior work has demonstrated that M pro functions as a homodimer.However, studies on the mechanism of dimerization have been challenging because the purified protease is mostly dimeric, dimerization-defective mutants lack proteolytic activity, and robust cell-based assays have yet to be reported.To enable work on M pro dimerization, we have developed a quantitative luciferase-based SARS-CoV-2 (SARS2) M pro biosensor that accurately reports protein dimerization in living cells and, upon purification, also in vitro.Cotransfection of cells with a construct expressing M pro fused to the 18 kDa LargeBiT of luciferase (LgBiT) and a second construct with M pro fused to the 1 kDa SmallBiT of luciferase (SmBiT) results in a reconstitution of luciferase activity in a dose-dependent manner that requires conserved residues within the dimerization interface.Proteolytic activity is dispensable for dimerization and, uniquely, a C145A catalytically inactive mutant exhibits enhanced dimerization signal likely due to lower cytotoxicity.M pro enzymes from multiple different coronaviruses also dimerize in this system, indicating mechanistic conservation.Interestingly, this dimerization biosensor also provides a quantitative read-out of inhibitor-facilitated dimerization.Covalent SARS2 M pro inhibitors such as nirmatrelvir cause a 3-to 5-fold increase in luciferase activity.Together with corroborating structural, biophysical, and molecular dynamics experiments, our studies support a model in which covalent M pro inhibitors such as nirmatrelvir simultaneously block catalytic activity and induce allosteric stabilization of the dimeric complex.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,001 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,002 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,002 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,002 | 0,002 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».