Highly Efficient Site-Specific and Cassette Mutagenesis of Plasmids Harboring GC-Rich Sequences
Notice bibliographique
Résumé
GC-rich sequences affect DNA replication, recombination and repair, as well as RNA transcription in vivo. Such sequences may also impede site-directed mutagenesis in vitro. P3a site-directed mutagenesis is a highly efficient method, but it has not been tested with plasmids possessing GC-rich sequences. Here we report that it is very efficient with a BRPF3 expression vector but unsuccessful with that for KAT2B. Because two GC-rich regions located within the synthetic CAG promoter and the KAT2B coding region may form guanine (G)-quadruplexes and hinder plasmid denaturation during PCR, we developed P3b site-specific mutagenesis, achieving an average efficiency of 97.5% in engineering ten KAT2B mutants. Importantly, deletion mutagenesis revealed that either of the two GC-rich regions is sufficient for rendering the plasmid incompatible with P3a mutagenesis. Consistent with this, only P3b mutagenesis worked efficiently with several widely used sgRNA/Cas9 expression vectors, which contain the CAG promoter, and with an expression vector for CDK13, which possesses an intrinsically disordered domain encoded by a GC-rich DNA fragment. Thus, this study highlights serious challenges posed by GC-rich sequences to site-directed mutagenesis and provides an effective remedy to address such challenges. The findings support that G-quadruplex formation is one mechanism whereby such sequences impede regular PCR-based mutagenesis methods.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction distillée sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Apprise à partir de 10 348 étiquettes directes de Codex et de 10 348 étiquettes directes de Gemma. Le mode candidate est l'union des têtes enseignantes seuillées; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont ni des étiquettes humaines ni des étiquettes directes de modèles de pointe.
Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule tête enseignante, pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».