Evidence of chitosanase involvement in the protection of bacteria against the antimicrobial activity of the chitosan

Le chitosane, un biopolymère composé de résidus de D-glucosamine et N-acétyl-Dglucosamine \nliés par liaisons P-(1,4), possède des applications industrielles multiples. \nRécemment le chitosane a reçu beaucoup d'intérêt grâce à son activité antimicrobienne. Le \nchitosane montre une activité antimicrobienne envers des nombreux microorganismes comme \nles bactéries, les champignons et les virus. Cette activité antimicrobienne est basée sur son \ncaractère cationique. Grâce à ses groupements aminés chargés positivement, le chitosane \ninteragit avec les résidus chargés négativement qui se trouvent au niveau de la paroi cellulaire \nbactérienne. Les enzymes possédant une activité chitosanase, catalysant l'hydrolyse des liens \nglycosidiques dans le chitosane, ont été trouvées chez beaucoup d'organismes, incluant des \nbactéries, des champignons et des plantes. Au cours des trois dernières décennies, les \nchitosanases ont été intensivement étudiées comme outils pour la transformation \nbiotechnologique du chitosane. Cependant, leurs fonctions physiologiques chez les microorganismes \nqui les produisent sont peu connues. Des études précédentes ont caractérisé les \nchitosanases en tant qu'enzymes métaboliques permettant aux bactéries d'utiliser le chitosane \ncomme sources de carbone et d'azote. \nLe but de ce projet de recherche était d'examiner la signification des chitosanases comme \nfacteurs possibles de résistance contre l'effet antimicrobien du chitosane. Nos travaux, ainsi \nque d'autres travaux effectués dans ce laboratoire, ont montré que l'expression d'un gène \nhétérologue de chitosanase dans Escherichia coli, une bactérie Gram-négative naturellement \ndépourvue d'activité chitosanolytique, augmente le niveau de résistance au chitosane. De plus, \nle niveau de résistance au chitosane est influencé par l'activité relative de la chitosanase \nhétérologue. L'expression d'une chitosanase hétérologue inactive n'a pas conféré de résistance \nau chitosane, fait qui confirme notre hypothèse selon laquelle les chitosanases peuvent jouer \nun rôle dans la protection contre l'effet toxique du chitosane. Afin d'obtenir des preuves \ndirectes soutenant ce rôle protecteur des chitosanases contre le chitosane, nous avons inactivé \nle gène codant pour la chitosanase CsnA de Streptomyces lividans TK24. Pour ce faire, nous avons développé un nouveau système permettant l'interruption génique et la délétion en cadre \nde lecture pour les streptomycètes, système utilisant le gène de la cytosine désaminase comme \nmarqueur négatif. L'interruption du gène de la chitosanase de S. lividans TK24 a eu comme \nrésultat une plus grande sensibilité de la part du mutant envers l'effet toxique du chitosane. \nNos expériences réalisées in vivo ont prouvé, qu'en présence du chitosane, la croissance du \nmutant ainsi que sa capacité à utiliser le xylose comme source de carbone ont été altérées en \ncomparaison avec la souche sauvage. Ces résultats représentent les premières preuves \ngénétiques du rôle protecteur d'une chitosanase contre l'effet bactéricide du chitosane. \nAu cours de la recherche de chitosanases poseedant de nouvelles caractéristiques, nous avons \ndéterminé les propriétés biochimiques de la chitosanase CsnA de Streptomyces coelicolor A3 \n(2). Nos études ont montré que CsnA est, sur beaucoup d'aspects, très semblable à la \nchitosanase CsnNl 74 de Streptomyces sp. Nl 74. Une caractéristique intéressante de CsnA est \nson mode de sécrétion. Le peptide signal de CsnA a un motif Tat-dépendant. CsnA est la \npremière chitosanase étudiée à être sécrétée par la voie de sécrétion Tat-dépendante. Ces \nétudes ont contribué à une meilleure compréhension du processus de sécrétion des \nchitosanases. \nDe nouvelles preuves concernant le rôle des chitosanases dans la protection des bactéries \ncontre l'effet bactéricide du chitosane ont été apportées également par les études de la \nlocalisation cellulaire de l'exo-P-D-glucosaminidase (CsxA) d'Amycolatopsis orientalis. CsxA \na un module de liaison aux hydrates de carbone (CBM35) caractérisé par une affinité peu \ncommune. Ce module attaché à la CsxA reconnaît comme substrat l'acide glucuronique, un \ncomposant de la paroi cellulaire des bactéries Gram-positives. De ce fait, nous avons analysé \npar microscopie à épifluorescence et microscopie confocale la localisation cellulaire de CsxACBM35 \nchez les cellules d'Amycolatopsis orientalis cultivées en présence de chitosane. \nL'analyse par microscopie a prouvé que CsxA est ancré à la paroi cellulaire bactérienne par \nl'intermédiaire de CBM35 qui interagit avec l'acide glucuronique. Grâce à cette localisation \nstratégique, l'exo-P-D-glucosaminidase d 'Amycolatopsis orientalis pourrait également \ncontribuer à la protection contre l'effet antimicrobien du chitosane. Les résultats obtenus pendant cette étude ont amélioré nos connaissances sur le rôle \nphysiologique des chitosanases chez les bactéries. Indépendamment de leur localisation \ncellulaire; intracellulaire, ancré à la paroi cellulaire ou sécrété, les chitosanases jouent un rôle \nimportant dans la résistance bactérienne au chitosane. De ce fait, nos résultats ont permis de \nmieux comprendre la polyvalence des fonctions des chitosanases chez les bactéries.

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