Protocol Development for the Discovery of Angiogenesis Inhibitors via Automated Methods Using Zebrafish and the Discovery and Validation of PD 81723 as a Novel Angiogenesis Inhibitor
Notice bibliographique
Résumé
Their optical clarity as larvae and embryos, small size, and high fecundity make zebrafish ideal for whole animal high-throughput screening. A high-throughput drug discovery platform (HTP) has been built to perform fully automated screens of compound libraries with zebrafish embryos. A Tg(kdrl:EGFP) line, marking endothelial cell cytoplasm, was used in this work to help develop protocols and functional algorithms for the system, with the intent of screening for angiogenesis inhibitors. Indirubin 3’ Monoxime (I3M), a known angiogenesis inhibitor, was used at various concentrations to validate the protocols. Consistent with previous studies, a dose-dependent inhibitory effect of I3M on angiogenesis was confirmed. The National Institutes of Health Clinical Collections Libraries I II (NIHCCLI) were screened for angiogenesis inhibitors with these methods as a pilot project for the HTP. The 727 compounds were screened in triplicate and 14 compounds were considered hits. The 5 compounds that corresponded to the most diminished endothelial network with a relatively normal overall morphology were selected for further analysis. A dose response experiment of each of the top 5 compounds was conducted and only PD 81723 and raclopride yielded a significantly smaller endothelial network. Evaluation of the chemical phenotypes of PD 81723 and raclopride led to the exclusion of raclopride as a possible candidate. PD 81723 appeared to be working in a dose-dependent manner and was selected as the main compound of interest. Zebrafish exposed to PD 81723 exhibited several signs of a diminished endothelial network due to the inhibition of angiogenesis. Immunochemistry experiments did not reveal any significant apoptotic or mitotic activity in the zebrafish. Assays with cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) elucidated the ability of PD 81723 to inhibit capillary tube formation, wound healing/migration, and proliferation of endothelial cells. An annexin V/PI flow cytometry assay did not reveal significant levels of apoptotic events in PD 81723 treated cells. These results indicate that PD 81723 may be driving endothelial cells into a quiescent state. In addition, immunoblotting revealed that PD 81723 significantly down regulated p21, AKT, VEGFR-2, p-VEGFR-2, eNOS, and p-eNOS, with no notable change in endogenous VEGF-A.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,005 | 0,003 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,002 | 0,002 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,002 | 0,002 |
| Bibliométrie | 0,003 | 0,002 |
| Études des sciences et des technologies | 0,002 | 0,001 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,002 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,002 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,016 | 0,010 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».