Solid-state NMR methodologies for the in situ study of molecular interactions between antimicrobial peptides and erythrocyte membranes

L'incidence des bactéries multirésistantes augmente dans le monde entier, et il est urgent de développer de nouveaux antibiotiques dotés de mécanismes d'action novateurs. Les peptides antimicrobiens (AMPs) sont considérés comme une avenue thérapeutique prometteuse et des antibiotiques à large spectre, car ils agissent en perturbant les membranes cellulaires bactériennes. Les AMP sont omniprésents dans la nature, produits par divers organismes et faisant partie intégrante de leur mécanisme de défense. Ces peptides présentent plusieurs modes d'action, notamment des interactions préférentielles avec les lipides des membranes cellulaires bactériennes. Leur action inclut la formation de pores dans les membranes ou leur micellisation via un mécanisme de type tapis. De nombreuses études ont démontré les propriétés antibactériennes des AMPs. Cependant, l'interaction avec les cellules mammifères a été moins étudiée, et il est donc important de vérifier et de comprendre leur action potentielle sur les cellules eucaryotes telles que les érythrocytes (globules rouges ou GR) pour développer des médicaments sécuritaires et ciblés. Dans ce contexte, la résonance magnétique nucléaire de l'état solide (RMN-ÉS) peut fournir des informations au niveau atomique sur l'interaction des AMP avec les membranes. Cette approche est généralement réalisée avec des membranes lipidiques modèles, cependant, compte tenu de la complexité des membranes cellulaires, la RMN-ÉS in cellulo se distingue maintenant comme un outil extrêmement précieux pour obtenir une vision plus large de l'action des AMPs. L'objectif de cette thèse était de comprendre l'effet des AMPs sur les membranes des érythrocytes au niveau atomique, et d'établir des approches de RMN-ÉS pour étudier les interactions entre les cellules entières et les peptides. Pour ce faire, l’auréine 1.2 et la caérin 1.1 ont été utilisées. Trois objectifs de recherche spécifiques ont été poursuivis: (1) Étudier l'interaction des AMPs in situ par RMN-ÉS du deutérium (2H) ; (2) Développer une méthodologie pour étudier ces interactions par RMN-ÉS du fluor-19 (19F) dans les cellules entières afin d’accélérer les mesures; (3) Établir une approche pour déterminer les distances internucléaires dans les cellules intactes basée sur la RMN-ÉS du 19F. Nous présentons d’abord l'incorporation d'acides gras déutérés et fluorés exogènes dans les membranes de fantômes d'érythrocytes. L'intégrité et la fluidité des membranes marquées est confirmée. L'étude de l'interaction de l’auréine et de la caérine avec les fantômes de globules rouges est révélée par la mesure de paramètres spectraux tels que les moments spectraux en 2H et 19F, l’anisotropie de déplacement chimique du 31P et du 19F, le déplacement chimique isotrope du 19F et les temps de relaxation. Des analyses en microscopie et des tests de fuite sont également réalisés sur des érythrocytes intacts et des membranes modèles. Dans l'ensemble, les résultats confirment que l'auréine interagit via un mécanisme de type tapis et que la caérine forme un pore dans la membrane, similairement à leur action sur les membranes bactériennes. Enfin, nous utilisons des membranes modèles incorporant des acides gras fluorés pour cartographier l'interaction du médicament fluoré rosuvastatine. La connectivité moléculaire est révélée entre la statine et le système lipide/acides gras, ainsi qu'entre les acides gras, en utilisant des expériences de RMN-ÉS bidimensionnelles homonucléaires et hétéronucléaires. Ce travail établit des bases solides pour des mesures futures en cellules entières. Cette thèse montre que l'action membranaire de médicaments, tels que les AMPs, peut être étudiée in situ sur les érythrocytes au niveau moléculaire, par une combinaison de marquage spécifique au 2H ou au 19F et d'expériences de RMN-ÉS. Elle met en évidence le rôle des interactions hydrophobes dans le mécanisme d'action des AMPs. D’une façon générale, elle ouvre la voie à la cartographie des médicaments dans une membrane lipidique intacte, et propose de nouvelles méthodologies robustes de RMN-ÉS susceptibles d'être utilisées pour l'étude de diverses cellules. \n_____________________________________________________________________________ \nMOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : peptides antimicrobiens, antibiotiques, globules rouges, fantômes érythrocytaires, bactéries, membrane lipidique, membrane cellulaire, marquage isotopique, profil lipidique, RMN de l’état solide, marquage isotopique, 2deutérium, fluor-19, anisotropie de déplacement chimique, moment spectral, relaxation, RMN bidimensionnelle

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