Preclinical development of dual EGFR/DNA targeting agent in glioblastoma

Cancer in general is an extremely complex, heterogeneous disease that is regulated by many oncogenic drivers and multiple signaling pathways.Glioblastoma (GBM) is one of the most frequent, invasive and devastating primary brain tumors with a median overall survival rate of about 15 months despite aggressive multimodality treatment with surgery, concurrent radiation therapy (RT) and chemotherapy (TMZ).Characteristics such as heterogeneity, invasion, acquired resistance, presence of tumor stem cells that lead to recurrence of these tumors are among the reasons that has made GBM the most difficult brain cancer to treat and has left scientists and clinicians with limited therapy options.Importantly, overcoming the complexity seen in GBM with single-targeted drugs has proven to be challenging.It is in this context that we are using a multitargeted approach termed "combi-targeting" or "combi-molecules" to target more than one oncogenic driver in tumors cells.Epidermal growth factor receptor (EGFR) dysregulation plays a critical role in GBM progression and DNA repair.Likewise, targeting DNA in tumor cells has been of a great interest in clinical management of solid tumors.We therefore investigated the strategy to combine a quinazoline ring (EGFR inhibitory arm) along with a chloromethyl group (DNA damaging arm) in one combi-molecule.By using this approach, we aim to not only enhance the potency of chemotherapeutic agents by simultaneously damaging DNA and inhibiting the EGFR pathway but also we aimed to target DNA repair by inhibition of the EGFR pathway which is known to be involved in DNA repair.Here, we showed that oral administration of the dual EGFR-DNA damaging combimolecule ZR2002 at doses up to 150mg/kg using either alternate or continuous treatment schedule was safe in athymic mice that have intact DNA repair pathway.ZR2002 was detected in the brain and plasma of mice using HPLC and LC/MS analysis.Interestingly, MALDI IMS confirmed the VII presence of ZR2002 and its metabolite (ZR01) in the brain of nude mice with intracranial tumors.Given the central role of GBM stem cells (GSCs) in tumor progression, chemo-and radioresistance and tumor relapse, we used patient-derived GSC neurosphere cultures, as a model to also examine the effects of ZR2002.ZR2002, inhibited neurosphere formation of GSCs cultures and induced significant DNA damage in these cell lines starting at a low concentration ( 1 µM).Interestingly, this novel combi-molecule hindered the proliferation of TMZ-sensitive and resistant mesenchymal in vivo derived GSC sublines.We also tested for the first time and elucidated the mechanism of action of ZR2002 and studied its ability to kill GBM established cell lines with different EGFR levels.ZR2002 induced potent submicromolar growth inhibitory effects in U87/EGFR isogenic cell lines and hindered their clonogenic potential.ZR2002 was also able to induce significant DNA damage in these cell lines at a low concentration (0.6 µM).ZR2002 inhibited EGF-induced autophosphorylation of EGFR/EGFRvIII and downstream Erk1/2 phosphorylation, significantly increased DNA strand breaks and induced wild-type TP53 activation in the established and stem cell lines tested.Its cytotoxic effects were mediated through a p53-dependent mechanism.Most importantly, oral administration of ZR2002 significantly increased survival in both the U87/EGFRvIII and TMZ-resistant GSC intracranial models.In sum, ZR2002, a unique binary EGFR/DNA combi-molecule with submicromolar potency imparts direct inhibition of EGFRvIIIinduced proliferation and tumor growth.Its broad anti-proliferative, DNA-damaging activity in GSCs and in vivo anti-tumor activity provide proof-of-concept for its clinical evaluation in GBM.VIII RÉSUMÉ Le cancer en général est une maladie extrêmement complexe et hétérogène régie par de nombreux facteurs oncogènes et par des voies multiples de signalisation.Le glioblastome multiforme (GBM) est l'une des tumeurs primitives du cerveau les plus fréquentes, invasives et dévastatrices, avec un taux de survie global médian d'environ 15 mois, malgré un traitement multimodal agressif ayant recours à la chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie.Des caractéristiques telles que l'hétérogénéité, l'invasion, la résistance acquise, la présence de cellules ressemblant à des cellules souches qui conduisent à la récurrence de ces tumeurs sont parmi les raisons qui expliquent la complexité du traitement du GBM et limitent les options de traitement.Notamment, surmonter la complexité observée dans le GBM avec des médicaments à cible unique s'est avéré difficile.C'est dans ce contexte que nous utilisons une approche multi-ciblée appelée «ciblage combiné» ou «molécules combinées» pour cibler plus d'un facteur oncogénique dans les cellules tumorales.Depuis, la dérégulation du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) joue un rôle essentiel dans la progression du GBM et la réparation de l'ADN.Cette cible a également suscité un grand intérêt pour la prise en charge clinique des tumeurs solides.Nous avons donc investigué la combinaison d'un cycle quinazoline (bras inhibiteur de l'EGFR) et un groupe chlorométhyle (bras pour endommager l'ADN) dans une molécule combinée.En utilisant cette approche, nous visons non seulement à renforcer la puissance des agents chimiothérapeutiques en endommageant simultanément l'ADN et en inhibant la voie de l'EGFR, mais également à cibler la réparation de l'ADN par inhibition de la voie de l'EGFR, connue pour son implication dans la réparation de l'ADN.Au cours de cette étude, nous avons montré que l'administration orale de ZR2002 à des doses allant jusqu'à 150 mg / kg a été tolérée suivant une posologie alternée ou continue chez des souris IX athymiques chez lesquelles la voie de réparation de l'ADN était intacte.ZR2002 a été détecté dans le cerveau et le plasma de souris à l'aide d'analyses HPLC et LC /MS.Notamment, MALDI IMS a confirmé la présence de ZR2002 et de son métabolite (ZR01) dans le cerveau de souris nues atteintes de tumeurs intracrâniennes.Le traitement de ZR2002 chez des souris NSG a montré une toxicité qui prouve le fait que ce médicament pourrait agir par ADN-PKcs.Étant donné le rôle central des cellules souches de GBM (GSC) dans la progression tumorale, la chimiorésistance et la radiorésistance et les rechutes tumorales, nous avons utilisé des cultures de neurosphères de GSC dérivées de patients, comme modèle pour examiner également les effets de ZR2002.ZR2002, inhibe la formation de neurosphères dans les cultures de GSC et induit des dommages importants et significatifs à l'ADN dans ces lignées cellulaires à partir d'une faible concentration (1 µM).Il est intéressant de noter que cette nouvelle molécule combinée a empêché la prolifération de lignées de GSC dérivées in vivo de cellules souches mésenchymateuses résistantes et sensibles à TMZ.Nous avons également testé pour la première fois et élucidé le mécanisme d'action de ZR2002, une molécule combinée double qui endommage l'ADN et l'EGFR, et nous avons étudié sa capacité à tuer des lignées cellulaires établies de GBM avec différents niveaux d'EGFR.ZR2002 a induit de puissants effets inhibiteurs de la croissance submicromolaire dans les lignées de cellules isogéniques U87/EGFR et entravé leur potentiel clonogénique.ZR2002 a été capable d'induire des dommages importants à l'ADN dans ces lignées cellulaires à partir d'une faible concentration (0,6 µM).ZR2002 a inhibé l'autophosphorylation induite par EGF de la phosphorylation d'EGFR / EGFRvIII et Erk1 / 2 en aval, a considérablement augmenté les ruptures de brins d'ADN et induit l'activation de TP53 de type « sauvage » non muté dans les lignées de cellules souches établies et testées.Ses effets cytotoxiques ont été médiés par un mécanisme dépendant de p53.Plus important, l'administration orale de ZR2002 a significativement augmenté la survie dans le modèle X intracrânien de la GSC résistant à U87/EGFRvIII et au TMZ.En résumé, ZR2002, une molécule combinée unique pour cibler l'ADN/EGFR de manière binaire avec une puissance submicromolaire confère une inhibition directe de la prolifération et de la croissance tumorale induites par EGFRvIII.Sa large activité antiproliférative, détruisant l'ADN dans les CSG et son activité antitumorale in vivo, consolident le concept de procéder à son évaluation clinique dans le GBM.

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