Relevance of the vitamin D receptor in complications associated with Crohn's Disease

La Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) comprende un grupo de enfermedades crónicas que cursan con inflamación y afectan al tracto gastrointestinal. Están caracterizadas por periodos de brotes y de remisiones clínicas. Aunque su causa es desconocida, se sabe que las complejas interacciones entre factores inmunológicos, microbianos, ambientales, nutricionales y genéticos juegan un papel importante en su etiología. Las dos principales manifestaciones son la Enfermedad de Crohn (EC) y la Colitis Ulcerosa (CU). Aunque comparten características, son patologías claramente diferenciadas. La CU se asocia con inflamación y ulceraciones en las capas mucosa y submucosa principalmente del colon. La EC puede aparecer en cualquier parte del tracto gastrointestinal de forma discontinua y la inflamación es asimétrica y transmural, formando granulomas no necróticos y fístulas. La mayoría de los pacientes con EC debutan con un fenotipo considerado inflamatorio (B1 en la clasificación de Montreal). Sin embargo, la inflamación subclínica presente en los periodos de remisión de la EC lleva en muchas ocasiones a complicaciones de la enfermedad como pueden ser estenosis (patrón estenosante o B2 en la clasificación de Montreal) y fístulas o abscesos (patrón penetrante o B3 en la clasificación de Montreal), que frecuentemente requieren de cirugía. Ambos patrones se caracterizan por la presencia de fibrosis intestinal. Este proceso es esencial en la cicatrización de la herida, un mecanismo fisiopatológico de reparación que conduce al depósito de diferentes proteínas en la matriz extracelular (MEC, red de macromoléculas extracelulares formadas por colágeno, glicoproteínas y enzimas, cuyo objetivo es proporcionar soporte a las células circundantes). Sin embargo, el desequilibrio entre la producción y la degradación de estas proteínas puede convertirse en una fibrogénesis incontrolada y persistente, causando un depósito excesivo de la MEC. Las citocinas, las quimiocinas y diversos tipos celulares como los fibroblastos están implicados en el proceso de fibrogénesis intestinal, que incluye la activación de miofibroblastos y otras células productoras de colágeno, la producción de TGF-β1, el daño celular, el reclutamiento de células inflamatorias y la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO). La EII puede ser considerada una enfermedad global con diferente prevalencia e incidencia en el mundo. Inicialmente, su incidencia se encontraba en los países más desarrollados, sin embargo, en los últimos años cada vez es más frecuente en países de Asia o el este de Europa. Los factores principalmente implicados en el desarrollo de la EII son elementos ambientales como el tabaco, la dieta o el estrés sumado a una alteración en la microbiota intestinal y en la respuesta inmune que lleva a una disrupción en la barrera intestinal y a un fallo en la defensa contra los microbios intestinales. La penetración de las bacterias en el contenido luminal, estimula respuestas del sistema inmunitario adaptativo promoviendo procesos inflamatorios crónicos, causando los daños característicos de la EII. El componente genético también ha sido ampliamente estudiado en la EII como un factor etiológico de la enfermedad. Un pequeño porcentaje de los pacientes con EII poseen historia familiar de la enfermedad y se ha demostrado que el riesgo de padecerla depende del grado de parentesco. Se han descrito más de 50 genes que predisponen a padecer EII. Gracias a estudios de asociación del genoma completo (GWAS) se han descubierto numerosas variaciones genéticas asociadas a la EII. La mayoría de estas variaciones implican el cambio en una sola base del ADN, son llamadas polimorfismos de nucleótido simple (SNP). El primer y más estudiado gen con susceptibilidad a la EC es un receptor de reconocimiento de patrones, llamado dominio de oligomerización por unión de nucleótidos que contiene la proteína 2 (NOD2). Además de incrementar el riesgo de sufrir la enfermedad, mutaciones en NOD2 están asociadas a pacientes con una EC ileal, estenótica y con enfermedad perianal. La mayoría de los genes implicados pertenecen a procesos relacionados con la EII, como la regulación de la respuesta inmune, la barrera intestinal o la autofagia. Entre ellos se ha descrito un polimorfismo genético en el receptor de la vitamina D, VDR como factor de riesgo para sufrir la enfermedad de Crohn, el rs731236 o TaqI. Este polimorfismo consiste en el cambio de una citosina por una timina en la secuencia de ADN en el exón 9 del gen VDR, lo que no produce ninguna alteración en la secuencia de aminoácidos de la proteína, es sinónima. La vitamina D (VD) o colecalciferol, es una hormona secoesteroide con funciones paracrinas y autocrinas esenciales en el metabolismo del calcio y la mineralización ósea. Esta forma es una pro-hormona no activa que se puede sintetizar bajo la acción de los rayos ultravioleta u obtenerse de la dieta. El colecalciferol sufre dos hidroxilaciones, una en el hígado y otra en los riñones, antes de convertirse en su metabolito activo, el calcitriol. Esta molécula se une al VDR que es un factor de transcripción perteneciente a la familia de receptores nucleares. Una vez en el citosol, VDR forma un heterodímero con el receptor X retinoide y se une al elemento de respuesta a hormonas (HRE) en el ADN, dando lugar a la expresión o trans-represión de determinados genes. La proteína disulfuro-isomerasa A3 (PDIA3), una isomerasa que actúa como chaperona en el plegamiento de proteínas, también se ha descrito como receptor de la Vitamina D. Existe una clara relación entre la Vitamina D y la EII. Diversos estudios describen niveles más bajos de esta vitamina en los pacientes con EII, especialmente con EC. Además, los pacientes deficitarios en Vitamina D poseen un mayor riesgo de incremento en la actividad clínica y de cirugías. En modelos murinos de colitis en ratones deficitarios de VDR se ha descrito una colitis más severa y mayor mortalidad. Con todo esto, la asociación entre esta vitamina y la enfermedad es clara, sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares detrás de estos efectos todavía se desconocen. OBJETIVOS El objetivo general de este trabajo es analizar la relevancia de los polimorfismos genéticos y los efectos de la vía VD/VDR en las complicaciones de la EC. Los objetivos específicos son: Analizar la relación que poseen diferentes SNP en genes relacionados con la EC, con las características clínicas de los pacientes con EC, evaluar la influencia de SNP TaqI en el gen VDR en las características clínicas de los pacientes con EC así como, en el curso clínico de la enfermedad, determinar los efectos que tiene en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con EC el SNP TaqI de VDR en: la expresión de VDR, en las citocinas inflamatorias y en la activación de linfocitos, evaluar la influencia de la EC en la expresión de VDR, PDIA3 y COL1A1 en resecciones intestinales humanas, analizar los efectos del SNP TaqI de VDR en el gen VDR en la expresión de VDR, PDIA3 y COL1A1 en fibroblastos intestinales humanos, estudiar la influencia de la EC y los efectos de la vitamina D en la expresión de VDR y PDIA3 en fibroblastos intestinales humanos y caracterizar los efectos de la vitamina D en la fibrosis intestinal murina. METODOLOGÍA Y RESULTADOS Relación entre las características clínicas de los pacientes de EC y los diferentes SNP en genes relacionados con la enfermedad. Los pacientes con EC y los controles fueron genotipados y las frecuencias genotípicas se analizaron para diferentes SNPs en genes relacionados con procesos relevantes en la patogénesis de la EII. En los SNP de los genes de NOD2, LAMB1 y ECM1 el genotipo homocigoto para el alelo de riesgo fue significativamente más frecuente en pacientes con EC que en los controles. El análisis de asociaciones entre las características clínicas de la enfermedad y el genotipo, a excepción de rs731236 en el gen VDR, no mostró ninguna relación significativa y relevante con la localización o el comportamiento en la EC. Sin embargo, algunas tendencias no significativas como, por ejemplo, en el SNP del gen CDH1 o del gen LAMB1, el genotipo considerado como de riesgo, podría asociarse con pacientes con EC que poseen un mejor pronóstico. El SNP rs731236 en el gen VDR está asociado con niveles disminuidos de proteína en PBMCs y con un patrón en la EC penetrante (B3). Los pacientes con EC homocigotos para el alelo C de riesgo en el SNP rs731236 o TaqI fueron diagnosticados a una edad más temprana, lo que es indicativo de un peor pronóstico de la enfermedad. Además, los pacientes con este genotipo exhibieron un mayor riesgo de tener un fenotipo de la enfermedad penetrante (B3) así como de sufrir cirugía. Esta asociación no se observó cuando los pacientes tenían una fístula perianal. Cuando se analizaron las frecuencias genotípicas del TaqI SNP entre pacientes con EC y donantes sanos se demostró que los pacientes con EC que presentan un fenotipo de comportamiento B3 eran significativamente más propensos a ser homocigotos para el alelo C que los controles, lo que reforzó la observación obtenida en la población de pacientes. El SNP TaqI no altera la secuencia de aminoácidos de la proteína VDR, es una mutación sinónima. Por ello, el primer análisis fue observar si el polimorfismo cambiaba la expresión de VDR. Para este propósito, el análisis se realizó en dos muestras diferentes. Primero, se genotiparon para el TaqI SNP dos líneas celulares de monocitos diferentes, y se detectó que la línea celular THP1 poseía un genotipo TT, por el contrario, los monocitos U937 eran genotipo CC. Aprovechando los genotipos de estas células, se analizó el ARNm de VDR y los resultados mostraron una reducción significativa en las células THP1. Sin embargo, las células U937 expresaron niveles más altos de citocinas proinflamatorias que los monocitos THP1. Posteriormente, se analizaron los niveles de ARNm y proteína VDR en PBMCs de pacientes con geno

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