DEALING WITH THE MAIN CHALLENGES OF FANCONI ANEMIA MOLECULAR DIAGNOSIS AND THERAPY

L'anèmia de Fanconi (FA) és un trastorn genètic rar de la reparació de l'ADN amb àmplia heterogeneïtat genètica, múltiples mutacions privades i alta taxa de mosaïcisme, que encara prejutgen el diagnòstic molecular en el cas de variants de difícil caracterització o de patogenicitat dubtosa. Els pacients amb FA també presenten insuficiència de la medul·la òssia i més susceptibilitat a tumors sòlids i neoplàsies hematològiques. Atès que els tractaments actuals només aborden els defectes hematopoètics, és indispensable trobar noves teràpies farmacològiques sistèmiques a FA. Intentem fer front a aquests obstacles a través de: i. Disseny d'una estratègia optimitzada de cribratge mutacional basada en seqüenciació dirigida de nova generació (t-NGS) i tècniques complementàries per a un diagnòstic molecular de FA més ràpid i exhaustiu. Caracteritzem 14/14 subjectes pertanyents a tres grups de complementació diferents, i reportem un total de 23 al·lels genèticament diferents, inclòs un de fundador. També desenvolupem una anàlisi estadística per inferir variants de número de còpia (CNVs) a partir de les dades de NGS i, per a les 5 delecions pronosticades, proporcionem taxes de detecció coincidents amb les de les tècniques de referència per a l'estudi de CNVs. A més, descrivim el cas d'un pacient amb una gran deleció i una variant de splicing coneguda compensada per una inserció de novo, resultant en un efecte potencial de teràpia gènica natural in vivo. ii. Validació de sistemes cel·lulars de tres proteïnes FANCA mutades però estables (Arg951Gln, Thr1131Ala, Phe1263del), aptes per a un cribratge d'alt contingut de fàrmacs, per tal d'identificar molècula/es capaços de rescatar-ne els fenotips. Per generar els models, transduïm vectors lentivirals amb les mutacions en una línia deficient per a FANCA que expressa una proteïna FANCD2 fluorescent. Aquestes cèl·lules no són capaces de monoubiquitinar FANCD2 o promoure'n la reubicació en focus de reparació de l'ADN, característiques pròpies de l'activitat de la ruta FA. Tot i confirmar l'expressió de la proteïna FANCA mutant en tots els models, només el del mutant Phe1263del va mostrar un fenotip cel·lular compatible amb la línia deficient per a FANCA; per contra, els altres dos models amb comportament de tipus salvatge es van descartar com a candidats per a l'HCS. Posteriorment, monitoritzarem la correcció de Phe1263del a través de la formació de focus FANCD2 fluorescents amb l'objectiu de trobar un fàrmac, possiblement ja aprovat per la Food and Drug Administration (FDA), per a una teràpia mutació- dependent personalitzada per a tots els trets clínics de FA. iii. Realització de cribratges CRISPR KO a tot el genoma per disseccionar noves interaccions sintètiques (SIs) amb els gens FA.Transduïm una línia FANCA deficient i el seu control, tots dos caracteritzats per l'expressió de Cas9, amb dues llibreries KO d'ARN guia (gRNA), una llibreria generada al laboratori ("llibreria interna") i una comercial anomenada Toronto KO version 3 (TKOv3). Durant els cribratges no vam introduir cap estímul extern, a fi d'analitzar els fenotips resultants de la competència proliferativa entre les cèl·lules sotmeses a supressió genètica. Per mantenir la representació de gRNAs/fenotips els cribratges van ser detinguts després de 10 duplicacions cel·lulars, després d'això vam aïllar l'ADN de totes les rèpliques i l'amplifiquem amb encebadors amb codi de barres per a NGS. A continuació, es va dur a terme l'anàlisi bioinformàtica i estadística del cribratge de la "llibreria interna", redactant una llista preliminar de gens amb baixa representació (SI letals) i enriquits (SI viables). Compararem aquests resultats amb els de seqüenciació del cribratge amb la TKOv3 i validarem els millors candidats per provar les SIs. L'assoliment dels objectius d'aquest projecte de tesi proporcionarà una estratègia integral per als desafiaments actuals d'AF, des del laboratori fins al llit del pacient i tornada.

Récupéré en direct depuis OpenAlex et désinversé. Les résumés ne sont pas conservés dans cette base de données : les index inversés représentent 8,6 Go des 9,3 Go de texte de la base, et le serveur dispose de 13 Go libres.