Directed evolution of a bacterial sialidase and characterization of mechanism based inactivation of glycosidases
Notice bibliographique
Résumé
Sialic acids are often found at the terminal positions on the glycan chains that adorn all vertebrate cells and glycoproteins.This prominent position confers an essential role to sialic acid residues in biology, evolution and disease propagation.The most widespread sialic acid family members are N-acetylneuraminic acid, N-glycolylneuraminic acid and Kdn, which is an abbreviation for 2-keto-3-deoxy-D-glycero-D-galacto-nononic acid.Enzymes that catalyze the removal of carbohydrate linkages from biological molecules are called glycoside hydrolases (GHs).These enzymes have been categorized into more than 130 different families.Glycoside hydrolase family 33 (GH33) contains exo-sialidases (E.C. 3.2.1.18,neuraminidases), from both eukaryotes and prokaryotes, which catalyze the hydrolysis of sialic acid from glycoconjugates.Interestingly, subtle differences exist in both the structure of the particular sialic acid and its position of attachment to glycoconjugate chains between humans and other mammals.These differences are indicators of the unique aspects of human evolution, and are relevant to understanding an array of human conditions.The present thesis reports on routes that we explored to further unravel the importance of sialic acids.We developed tools to probe for various sialic acid structures such as Kdn.To this end, we constructed a random mutant library of the neuraminidase from the soil bacterium Micromonospora viridifaciens (MvNA) and identified a number of recurring mutations in the sialidase gene which lead to a more efficient hydrolysis of synthetic natural substrate analogues such as 8FMU α-Kdn-(2→6)β-D-Galp.We also using the available structure of wild type MvNA bound to the natural inhibitor, DANA, to identify amino acids potentially involved in recognition and binding to acetylated sialic acids and generated genetic libraries which we used along with positive and negative evolutionary screens to identify several clones capable of hydrolyzing Kdn glycosides more efficiently than Neu5Ac substrates.Kinetic studies on these clones allowed for determination of enzyme efficiencies and specificities.We also report our study of covalent inhibition of α-glucosidase from Saccharomyces cerevisiae (GH13).The measured pH-rate profiles for inhibition and reactivation as well as the corresponding catalytic and inhibitory proficiencies suggested that inhibition results from the formation of carbenium ions in the active site that are trapped rapidly by an enzymatic residue.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,001 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».