Exploring the role of Sacsin and S100B proteins in cytoskeleton organization

A Ataxia Espática de Charlevoix-Saguenay (ARSACS) é uma doença neurológica rara hereditária, que se caracteriza por perda de células de Purkinje no cerebelo, axonopatia do neurónio motor e neuropatia periférica. É uma doença que se manifesta precocemente, com ataxia cerebelar entre os 2 e os 5 anos de idade acompanhada de disartria e nistagmo. A doença foi inicialmente identificada e caracterizada na região geneticamente isolada de Charlevoix-Saguenay no Québec, Canadá, em 1978. Embora a incidência e prevalência mundiais sejam desconhecidas, ARSACS é considerada uma das ataxias recessivas mais comuns, com casos da doença na Tunísia, Itália, Turquia, Espanha, Japão, Países-Baixos, Portugal e China. Não existindo cura, a única terapia consiste na mitigação dos sintomas, nomeadamente através de exercício físico e terapia da fala. O diagnóstico é realizado através de testes genéticos, uma vez que a doença se encontra associada a mutações no gene SACS. O gene SACS, localizado no cromossoma 13q12 do ser humano, contém 10 exões e codifica a proteína sacsina, com 4579 aminoácidos e 520 KDa. Esta enorme proteína tem função de chaperão e encontra-se predominantemente em células de Purkinje, no cerebelo, tendo uma distribuição subcelular maioritariamente citoplasmática e alguma sobreposição com a mitocôndria. Mais de 200 mutações estão associadas à ARSACS, mas independentemente do tipo de mutação e da localização, nos pacientes de ARSACS a sacsina está praticamente ausente, indicando uma perda de função da proteína. Ratinhos e peixes-zebra knockout para sacsina exibem características histopatológicas e neurológicas consistentes com ARSACS e são por isso bons modelos da doença. A ausência de sacsina leva a perturbações do citoesqueleto, afetando principalmente os filamentos intermédios e resultando em acumulações na região perinuclear. Além disso, a deleção da sacsina leva a perturbações na proteostase e autofagia, disfunção mitocondrial e formação de espécies reativas de oxigénio. Outros organelos estão também desorganizados, como o complexo de Golgi, lisossomas e retículo endoplasmático. Estudos anteriores têm sido focados em neurónios, mas evidências atuais indicam que as células gliais, incluindo astrócitos e microglia, também expressam sacsina em grandes quantidades. Os cérebros de ARSACS mostram forte neuroinflamação com ativação de astroglial e microglia, e o papel fulcral destas células durante o desenvolvimento neural, a neuroinflamação e a neurodegeneração tem sido desvendado nas últimas décadas. Portanto, é interessante perceber as consequências da remoção da sacsina em células gliais e o papel que elas podem ter na doença de ARSACS. A S100B faz parte da família de proteínas S100, pequenas proteínas de ligação a cálcio que podem atuar como citocinas/alarminas, interagindo com variadas moléculas-alvo tais como recetores acoplados a proteínas G, RAGE, Toll-like e proteoglicanos, iniciando eventos pró-inflamatórios. A proteína S100B, maioritariamente produzida e excretada por astrócitos, tem vindo a ser usada como biomarcador de traumatismo craniano e encontra-se associada a diversas doenças neurodegenerativas. A sua função parece ser dependente da sua concentração, podendo ser neuro-protetora (nanomolar) ou pró-inflamatória (micromolar). A S100B tem impacto na proliferação celular, sobrevivência, diferenciação e homeostase de cálcio. Recentemente, foi descoberta uma nova função como chaperão molecular, capaz de se ligar a proteínas como Aβ42 e Tau, envolvidas em doenças neurodegenerativas como Alzheimer e Parkinson, e prevenir a sua agregação. Desenvolvemos recentemente um modelo de ARSACS com células gliais deletando a sacsina de células astrogliais de ratos através da técnica de CRISPR/Cas9. Neste modelo, os principais filamentos intermédios astrogliais, vimentin, nestin e GFAP encontram-se sobre-expressos e acumulados junto ao núcleo, com concomitante redistribuição da rede mitocondrial dessa zona. A proteína S100B também se encontra extremamente sobre-expressa neste modelo. Este projeto partiu com o intuito de dar continuidade à caracterização molecular e celular do primeiro modelo glial da doença da ARSACS, bem como de um novo modelo farmacológico recorrendo ao composto withaferin A. Procurámos também compreender o papel da sobre-expressão de S100B neste modelo, analisando a sua distribuição em condições normais e patológicas, bem como avaliando os efeitos dos níveis e da atividade de S100B no fenótipo do modelo glial da ARSACS. Durante a caracterização molecular do modelo glial de ARSACS, pudemos confirmar a mutação do gene SACS no genoma das células C6Sacs-/-, localizada no exão 6. Foi também confirmado o aumento de expressão e agregação perinuclear dos filamentos intermédios gliais. Para compreender a natureza bioquímica dos agregados justanucleares, um conjunto de corantes foram testados em extratos proteicos. Os resultados foram variáveis e inconclusivos, à exceção da clara ausência de agressomas ou outras estruturas amiloides. Observou-se uma diminuição nos níveis das proteínas ERO1 e NQO1 após deleção da sacsina, o que poderá ser indício duma relação entre a função ou stress do retículo endoplasmático e a ARSACS, bem como uma possível maior suscetibilidade aos efeitos oxidativos das quinonas. Apesar da expressão de plectina não ter sido encontrada alterada, foi observada uma alteração na sua distribuição citoplasmática. Também as expressões de GLRX3 e a Ube3A não foram encontrados alteradas. Para explorar o papel da sobre-expressão da S100B nas células C6Sacs-/-, estas foram transfetadas com um plasmídeo contendo a proteína S100B acoplada a uma proteína fluorescente. Observou-se uma acumulação de S100B em torno do núcleo e entre o núcleo e os agregados nas células KO, enquanto nas células WT estava uniformemente distribuído. S100B apresentou co-localização mitocondrial em ambos os casos. As células KO também exibiram elevados níveis de secreção da S100B. A inibição da expressão ou atividade da S100B por meio de siRNA, pentamidina ou nanocorpos anti-S100B resultou num aumento da disrupção mitocondrial das células KO, sugerindo que a sobre-expressão da S100B se deve a uma tentativa por parte da célula de evitar a completa destruição da integridade da rede mitocondrial. A administração de S100B exógena, previamente demonstrada como não tóxica, revelou uma tendência positiva nas células, embora os resultados sejam preliminares e não significativos. A inibição da S100B não afetou os agregados de nestina. No entanto, a técnica de WB mostrou que a diminuição de S100B por siRNA levou a uma diminuição da expressão de nestina. Estes resultados combinados sugerem um papel crucial da S100B e da própria sacsina na organização do citoesqueleto e particularmente da rede mitocondrial nas células gliais. A withaferin A é um composto natural que se liga à vimentina e provoca a agregação perinuclear dos filamentos intermédios em células não gliais. Nas células gliais C6 WT, a withaferin A não só provocou uma agregação perinuclear da nestina, como levou a uma diminuição da expressão de sacsina. Apesar da mitocôndria ter sofrido ligeiras alterações, estas não foram tão significativas como nas células KO. É importante salientar que o fenótipo é reversível ao retirar withaferin A do meio celular, possivelmente devido à presença da sacsina nestas células. Estes resultados sugerem duas hipóteses: 1) para além do impacto direto que a withaferin A tem nos filamentos intermédios, a diminuição dos níveis da sacsina também pode contribuir para o composto liga-se também à sacsina e a sua diminuição provoca a agregação proteica ou 2) o efeito da withaferin A sobre os filamentos intermédios e a sua agregação perinuclear levam à diminuição da sacsina. Neste modelo, a expressão proteica revelou-se contraditória ao que acontece nas células KO, não havendo sobre-expressão de S100B, nem diminuição de STAT3, ERO1 ou SMAD1. As diferenças poderão ser justificadas por diferenças entre um efeito crónico como acontece no modelo genético e um efeito transiente, como é o caso do modelo farmacológico. Assim, a sobre-expressão da S100B poderá ser resultado direto da deleção da sacsina ou poderá necessitar de uma acumulação proteica e/ou disrupção mitocondrial crónica. Algumas terapias mais recentes para ARSACS passam pela recuperação do normal funcionamento mitocondrial. Estes resultados vão de encontro a essas terapias, uma vez que sugerem um impacto da sacsina e a da S100B no normal funcionamento da célula e organização mitocondrial. A proteína S100B para além dos seus efeitos já conhecidos no processo de inflamação e recentemente como chaperão molecular, terá ainda uma forte componente de organização mitocondrial. Para além disso, a diminuição de expressão da sacsina através da withaferin A sugere a utilização deste composto no estudo da doença de ARSACS. Estes resultados abrem portas para novos estudos e desenvolvimento de novas terapias em doenças que se caracterizam por disfunção mitocondrial, nomeadamente outras doenças neurodegenerativas.

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