Exploring the adhesion mechanisms of human peripheral blood monocytes onto oxygen and nitrogen-rich gradient plasma polymer-coated fluoropolymers

Dendritic cell (DC)-based immunotherapy is a promising strategy to treat malignant diseases.Traditionally, DCs are obtained by differentiating monocytes (Mo-DCs) in open flask systems using tissue culture polystyrene (TCPS) as the substrate.Disposable culture bags composed of flexible fluoropolymers such as fluorinated ethylene propylene (FEP) represent promising alternatives to polystyrene flasks to minimize the risks of contamination when producing therapeutic cells for clinical use.The transition from the more hydrophilic TCPS (adherent culture) to the more hydrophobic fluoropolymers (suspension culture) entails significant changes in the substrate surface properties which can impact protein adsorption and cell product attributes.The impact of culture substrate materials on the cell-surface interactions and the resulting cell fate decisions of ex vivo-derived Mo-DCs remains to be elucidated.Despite the hydrophobicity of FEP, we previously observed monocyte adhesion to FEP through mechanisms that were unclear.The hypothesis investigated in this thesis was that Mo-DC surface interactions can be modulated by tuning the substrate surface chemistry.To this end, we functionalized FEP with in-housedeveloped oxygen-rich and nitrogen-rich gradient plasma polymer coatings (GPPCs) that were generated by plasma-enhanced chemical vapor deposition (PECVD).These GPPCs introduce Oand N-containing functional groups at the substrate surface which are retained after steam sterilization and in aqueous media.We conducted studies to investigate the impact of GPPCs on monocyte adhesion as compared to conventional TCPS flasks and untreated FEP bags (referred to as FEP(-)).Monocyte initial adhesion onto O-and N-rich GPPCs was significantly enhanced as compared to FEP(-), and was comparable to TCPS (57±6%, 51±6%, 34%±6% and 54±7% of the seeded cells adhered to each surface, respectively).Immunofluorescence staining indicated that monocytes adhered to FEP(-), O-and N-rich GPPCs through focal adhesions, with the highest cell spreading being observed on O-GPPC.In addition, both GPPCs enhanced monocyte adhesion strength under tangential flow.To probe the mechanisms of plastic adherence, we seeded monocytes in the presence of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and RGD (Arg-Gly-Asp) peptide to hinder integrin interactions with binding partners.The reduced cell adhesion indicated the involvement of integrins, especially RGD-binding integrins, in mediating monocyte adhesion to FEP substrates. P a g e | iiAfter probing different blocking strategies of integrin subunits, integrin α5/β1 (CD49e/CD29) was identified as a putative monocyte-FEP adhesion mediator based on a >50% reduction in monocyte initial adhesion.In summary, the results presented in this thesis demonstrated the strong translational potential of the GPPCs in developing functionalized FEP bags with enhanced interactions with cells.Our improved understanding of monocyte adhesion mechanisms will inform the engineering of culture substrate materials that can be tailored towards pro-adherent or pro-suspension cultures of Mo-DCs depending on the targeted applications.This strategy could improve the in vitro manufacturing efficiency and in vivo therapeutic efficacy of Mo-DC immunotherapies.P a g e | iii RÉSUMÉ L'immunothérapie basée sur les cellules dendritiques (CDs) est une stratégie prometteuse pour traiter les pathologies cancéreuses.Traditionnellement, les CDs sont obtenues par différenciation de monocytes (Mo-CD) dans des systèmes de flacons ouverts utilisant du polystyrène pour la culture tissulaire (TCPS) comme substrat.Les sacs de culture en fluoropolymères flexibles tels que l'éthylène-propylène fluoré (FEP) apportent une solution permettant la génération de thérapies cellulaires cliniques dans des environnements fermés avec un risque de contamination considérablement réduit par rapport aux systèmes ouverts.Cependant, les propriétés de surface du substrat peuvent avoir un impact considérable sur l'adsorption des protéines et les interactions entre les cellules et la surface.Le passage du TCPS hydrophile (culture adhérente) aux fluoropolymères hydrophobes (culture en suspension) entraîne des changements significatifs dans le comportement des cellules à l'interface du substrat.À ce jour, notre compréhension de l'impact de la nature du substrat sur les interactions cellule-surface et la différentiation cellulaire des Mo-CDs dérivées ex vivo demeure incomplète.De plus, bien que les surfaces en FEP offrent des interactions limitées avec les cellules en raison de leur caractère hydrophobe, nous avons observé l'adhésion des monocytes aux sacs en FEP par des mécanismes qui ne sont pas définis.L'hypothèse étudiée dans cette thèse est que les interactions cellule-surface peuvent être modulées en ajustant la chimie de surface du substrat.À cette fin, nous avons fonctionnalisé le FEP avec des revêtements polymériques à gradient déposés par plasma (GPPC) riches en oxygène et en azote, générés par dépôt chimique en phase vapeur assisté par plasma (PECVD).Ces GPPCs à la chimie finement ajustée introduisent des groupements fonctionnels contenant de l'oxygène et de l'azote à la surface du substrat et leur intégrité a été vérifiée en milieu aqueux et lors de la stérilisation à la vapeur.Nous avons mené des études pour examiner l'impact des GPPCs sur le comportement d'adhésion des monocytes en les comparant aux flacons TCPS conventionnels et aux sacs en FEP non traité (appelés FEP(-)).L'adhésion initiale des monocytes sur les O-et N-GPPCs était significativement plus élevée que sur le FEP(-), et était comparable à celle observée sur le TCPS (57 ± 6%, 51 ± 6%, 34% ± 6% et 54 ± 7% des cellules ensemencées ont adhéré sur chaque surface, respectivement).La coloration par immunofluorescence a indiqué que les monocytes adhéraient aux surfaces FEP(-), O-et N-GPPC par le biais d'adhésions focales.Le nombre d'adhésions focales et l'étalement cellulaire étaient les plus élevés sur les surfaces recouvertes de O-GPPC.En outre, les deux GPPCs ont augmenté la force d'adhésion des monocytes sous flux tangentiel.P a g e | iv Afin d'explorer les mécanismes d'adhésion cellulaire au plastique, nous avons ensemencé des monocytes en présence de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et du peptide RGD (Arg-Gly-Asp).La réduction de l'adhésion cellulaire en présence du RGD indique un rôle des intégrines se liant au RGD dans les mécanismes d'adhésion des monocytes aux substrats en FEP.Un immunophénotypage complet du système d'intégrines exprimées par les monocytes et des expériences d'inhibition utilisant des anticorps monoclonaux ont été réalisés afin d'identifier plus précisément les récepteurs spécifiques impliqués dans le processus d'adhésion.Le blocage de l'intégrine α5/β1 (CD49e/CD29) a conduit à une réduction de plus de 50% de l'adhésion initiale des monocytes, confirmant son rôle clé en tant qu'intermédiaire dans l'adhésion cellulaire aux surfaces en FEP.En résumé, les résultats présentés dans cette thèse ont démontré le fort potentiel translationnel des GPPCs dans le développement de sacs en FEP fonctionnalisés avec des interactions améliorées avec les cellules.De plus, compréhension accrue des mécanismes d'adhésion des monocytes permettra de concevoir des substrats de culture pouvant favoriser ou plutôt réduire l'adhérence cellulaire en fonction des applications visées, optimisant ainsi l'efficacité de la fabrication in vitro et l'efficacité thérapeutique in vivo des immunothérapies Mo-CD.

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