Fingerprinting, bioattivita e sicurezza di droghe a terpeni e polifenoli

Le droghe oggetto dello studio
\nAttività: il progetto prenderà in considerazione fonti di miscele terpeniche o di polifenoli, di origine amazzonica (Hedychium coronarium, Piper imperiale, Peperomia galoides foglie), africana (Juniperus oxycedrus, Juniperus excelsa, Pinus pinea, Cryptocarya massoia) e indiana (Terminalia chebula).
\nMotivazioni della scelta: la scelta del materiale vegetale è vincolata a diversi aspetti: a) il gruppo di ricerca da diversi anni si occupa di fonti vegetali di provenienza sud-americana, africana ed indiana con particolare riferimento a droghe ricche in terpeni e composti polifenolici, e tale progetto è una delle soluzioni consequenziali a tale impostazione; 
\nb) lo studio etno-farmaco-botanico delle fonti precede, e accompagna sempre, lo studio biologico farmaceutico che ne segue: tale approccio ci ha permesso di individuare le fonti in oggetto come elemento di studio; 
\nc) alcune delle droghe e delle miscele terpeniche scelte presentano una letteratura modesta, datata, o assente; 
\nd) nessuna delle droghe e delle miscele terpeniche considerate è stata studiata con il profilo e la progettualità qui presentate.
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\nLe metodiche estrattive:
\nAttività: la scelta del modello estrattivo è il primo passo per valutare sul piano fitochimico resa, qualità e quantità delle molecole di interesse, rapporti qualitativi e quantitativi delle specie chimiche. In base al differente approccio estrattivo è possibile valutare successivamente quale risulti più adeguato ad una maggiore efficacia e sicurezza salutistica del prodotto. Saranno applicate metodiche estrattive classiche quali distillazione, soxhlet, SFE e con estrattore Naviglio (per molecole termolabili). Il nostro gruppo di ricerca ha, rispetto all’approccio e alle metodiche scelte, esperienza pregressa e consolidata (Bruni et al. Phytochem. Anal. 13, 257–261, 2002; Sacchetti and Bruni. Efficiency of extracting vitamin E from plant sources. In: Encyclopedia of Vitamin E. Victor R Preedy and Ronald R Watson Eds.; CABI Publishing, Wallingford, Oxon, OX10 8DE, UK. 2007). 
\nObiettivi: individuare per ciascuna droga il modello estrattivo e le condizioni più adatte:
\na) ad una resa ottimale; 
\nb) ad un profilo composizionale in grado di esprimere attività salutistica efficace e sicura; 
\nc) ad un ridotto time consuming; 
\nd) adeguate ad uno scale up verso l’aspetto produttivo efficace in termini sia di operatività sia economici.
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\nCaratterizzazione fitochimica delle miscele terpeniche ottenute e/o polifenoliche
\nAttività: la caratterizzazione avverrà valutando singolarmente e combinando le evidenze che emergeranno da analisi GC, GC-MS, HPLC-MS, HPTLC-MS ed 1H/13C-NMR seguendo un modello già consolidato per il nostro gruppo di ricerca anche per matrici analoghe (Guerrini et al. J. Agric. Food Chem. 57: 4103–4111, 2009; Guerrini et al. Environ. Toxicol Pharmacol. 27: 39-48, 2009; Sacchetti et al. Nat. Prod. Res. 21: 167-179, 2007; Guerrini et al. J. Agric. Food Chem. 54: 7778-7788, 2006; Sacchetti et al. Flav. Fragr. J. 21: 674-676, 2006). 
\nObiettivi: individuare per ciascuna miscela terpenica e/o polifenolica tutti gli elementi più adeguati:
\na) ad un fingerprinting dettagliato e completo (profilo gas cromatografico GC-MS, HPLTC-MS, NMR) e nel caso di droghe a contenuto flavonoidico o polifenolico, come le droghe del genere Terminalia, ad una caratterizzazione via NMR, HPTLC-MS e HPLC-MS.
\nb) alla identificazione e caratterizzazione di ciascuna specie chimica presente nella miscela (profili NMR e banche dati); 
\nc) alla possibilità di riconoscere e caratterizzare dal fingerprinting differenti estratti che poi potranno esprimere per efficacia e sicurezza la più corretta attività salutistica: strumento di controllo di qualità in linea (scale up) e strumento di predizione sulla bioattività.
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\nBioattività dei fitocomplessi 
\nAttività: l’indagine sull’attività biologica delle miscele terpeniche e polifenoliche sarà incentrata sulla valutazione dell’attività antiossidante, antimicrobica, citotossica, mutagena e mutageno-protettiva seguendo protocolli di ricerca consolidati e innovativi per le matrici in oggetto (Guerrini et al. Environ. Toxicol. Pharmacol. 27: 39-48, 2009; Bruni et al. Fitoterapia, 77: 538-545, 2006; Guerrini et al. J. Agric. Food Chem. 54: 7778-7788, 2006). Verrà inoltre introdotta la valutazione dell'attività su linee cellulari umane, aspetto innovativo per il nostro gruppo di ricerca.
\nAttività antiossidante: saranno impiegati saggi in vitro quali DPPH test e DPPH-(HP)TLC bioautographic assay; beta-carotene bleaching, frequentemente impiegato nella valutazione di miscele o composti lipofili; test del citocromo C, in cui si valuta la capacità di inibire la riduzione del citocromo causata dal radicale superossido.
\nAttività antimicrobica: saranno utilizzati ceppi ATCC ed isolati clinici del lievito patogeno Candida albicans, responsabile di diffuse e importanti dermatomicosi, e ceppi batterici Gram positivi (Staphylococcus aureus subsp. aureus, Enterococcus foecalis) e negativi (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) responsabili, ad esempio, delle più comuni affezioni quali disturbi da raffreddamento ed enterocoliti. A questo scopo, saranno impiegate tecniche tradizionali su terreno solido (Disk Diffusion Assay), liquido (Microplate reader) e (HP)TLC-bioautographic assay allo scopo di individuare gli estratti più attivi e di determinare la minima concentrazione inibente (MIC) e battericida (MBC).
\nAttività citotossica, mutagena e mutageno-protettiva: le proprietà citotossiche, mutageniche e anti-mutagene saranno valutate con saggi a breve termine che utilizzano organismi a struttura procariote (ceppi di Salmonella tiphymurium, test di Ames; Escherichia coli, SOS Chromotest) e organismi ad organizzazione eucariote (ceppo D7 di Sacharomyces cerevisiae) come simulatori di sezioni del complesso contesto di evoluzione della cancerogenesi e problematiche correlate.
\nIl test di Ames con Salmonella typhimurium, è utilizzato sia per la valutazione della mutagenicità, sia messo a punto ed adattato alla valutazione anche dell'antimutagenicità (Maron, Ames, Mutat Res 113:173-215,1983). Intendiamo anche avvalerci del modello microbiologico SOS Chromotest, sviluppato su E.coli (Quillardet et al., Proc.Nat.Acad.Sci. 79:5971-5975,1982). Questo test si avvale di un ceppo di E. coli con un gene reporter (accoppiato con un sistema di riparo SOS), che codifica per l’enzima beta-galattosidasi. Saranno utilizzati kit commerciali (ENVIRONMENTAL BIO DETECTION PRODUCTS INC, EBPI, Canada), che consentono una rapida ed affidabile stima dell’azione mutagena ed antimutagena con la possibilità di stimare per via colorimetrica la concentrazione della fosfatasi alcalina come indicatore di tossicità. Queste valutazioni saranno integrate da evidenze ottenute con un sistema biologico eucariote che impiega il lievito Saccharomyces cerevisiae, ceppo D7, che può essere usato per valutare l'induzione di mutazioni puntiformi, ricombinazione mitotica e conversione genica (Zimmermann et al. Mutat Res 133:199-244,1984). Al fine di includere nei test la possibile attivazione metabolica sia dei controlli genotossici positivi che dei modulatori vegetali, verranno utilizzati sistemi adeguati a ciascun saggio come da letteratura correlata (Quillardet et al., Proc.Nat.Acad.Sci. 79:5971-5975,1982; Del Carratore, Mutat Res 121:117-123,1983; Maron, Ames, Mutat Res 113:173-215,1983). 
\nCome ulteriore estensione delle valutazioni di bioattività per quegli estratti particolarmente efficaci e sicuri, saranno effettuate valutazioni in vitro su linee cellulari umane.
\nObiettivi: individuare e selezionare quegli estratti particolarmente attivi per efficacia e sicurezza per le bioattività saggiate.

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