Caractérisation du mode d'action d'agents anti-leishmania actuels et en développement à l'aide de criblages fonctionnels

La leishmaniose est la maladie parasitaire la plus mortelle après le paludisme et il n'existe pas de vaccin chez l'homme. Des traitements sont actuellement disponibles, mais ils sont coûteux, présentent des effets secondaires non négligeables, sont peu spécifiques et des résistances émergent. Les principales molécules utilisées sont les dérivés d'antimoine pentavalent, l'amphotéricine B, la miltefosine et la paromomycine. Découvrir de nouvelles molécules, préciser le mécanisme d'action des molécules anti-leishmania connues et plus généralement étudier la résistance est donc essentiel dans la lutte contre la leishmaniose. Ceci permettra d'améliorer l'utilisation des drogues, de minimiser l'apparition de résistances et de préciser les mécanismes employés par les parasites. Dans la cadre de cette thèse, mes objectifs étaient de déterminer le potentiel thérapeutique de molécules en développement ainsi que d'élucider les mécanismes de résistance et les cibles de médicaments connus ou en développement chez Leishmania. Dans le Chapitre 1 j'ai étudié le potentiel thérapeutique de trente-huit nouveaux composés thiophène. Une sélection de mutants couplée au séquençage haut débit (Sel-seq) criblée avec le candidat GC1-19, ayant une activité plus spécifique contre L. infantum JPCM5, a permis de mettre en évidence une conversion génique au niveau du locus ABCG2, impliquée dans la résistance. L'étude de cette molécule par clonage fonctionnel couplé au séquençage haut débit (Cos-seq) a démontré que la surexpression d'une tryparédoxine peroxydase est responsable d'une faible résistance au composé GC1-19. Les dérivés thiophènes sont donc des constructions d'intérêt pour le développement de médicaments contre la leishmaniose et les criblages Sel-seq et Cos-seq sont efficaces pour déterminer quels sont les gènes impliqués dans la résistance. Afin de mieux comprendre le métabolisme des folates, j'ai réalisé une mutagenèse chimique couplée au séquençage haut débit (Mut-seq) de L. major Friedlin avec une sélection au méthotrexate (MTX) (Chapitre 2). Vingt clones ayant une diminution de la susceptibilité au MTX de 2 à 400 fois ont été séquencés. Des mutations récurrentes ont été observés dans des gènes connus pour être impliqués dans le métabolisme des folates, dont les gènes FT1, DHFR-TS et PTR1, ou dans des gènes qui n'avaient jamais été associés au métabolisme des folates comme la L-galactolactone oxidase et une méthyltransférase. Pour la première fois, j'ai mis en évidence des mutations ponctuelles et des évènements de conversion géniques dans FT1, ainsi que des mutations ponctuelles dans DHFR-TS qui confèrent de la résistance au MTX. J'ai également démontré un effet dominant positif de deux mutations dans PTR1 ainsi que d'une mutation dans DHFR-TS. La sur-expression des versions sauvages de la L-galactolactone oxidase et d'une méthyltransférase dans les mutants appropriés les resensibilise au MTX. Le Mut-seq a également montré son efficacité lorsqu'il est couplé à une sélection avec du SbIII (Chapitre 4). Il a permis de mettre en évidence la kinase CDPK1, impliquée à la fois dans la résistance à la PMM et au SbIII. Son inactivation partielle confère de la résistance au SbIII et il reste à déterminer si les mutations ponctuelles retrouvées sont responsables de la résistance observée. Ces études montrent l'importance de l'utilisation de nouveaux criblages fonctionnels, ici le Mut-seq, pour découvrir de nouveaux gènes ayant un lien avec la résistance ainsi que de nouveaux mécanismes employés par le parasite au niveau de gènes déjà associés à la résistance. Le transporteur AdoMet et les transporteurs de folate FT1 et FT5, des transporteurs membranaires de la famille des FBTs localisés sur le chromosome 10, ont été caractérisé fonctionnellement. Dans le Chapitre 3, la totalité de ce locus ainsi qu'un FBT sur le chromosome 19 ont été étudié par délétion génique et expériences de localisation cellulaire. La délétion du locus du chromosome 10, contenant 7 gènes FBT, confère de la résistance à la sinefungine et au MTX. Six de ces protéines sont situées au niveau de la membrane plasmique, tout comme le FBT présent sur le chromosome 19. La délétion de ce dernier n'impacte pas la susceptibilité au MTX. Ensemble, ces travaux de recherche montrent l'efficacité et la complémentarité des criblages génomiques Sel-seq, Mut-seq et Cos-seq pour découvrir de nouveaux mécanismes de résistance et des cibles cellulaires. Ces criblages ont montré leur utilité aussi bien en réalisant la sélection avec un médicament utilisé contre la leishmaniose en thérapie, les antimoniés, mais aussi avec un médicament utilisé contre d'autres maladies, le MTX, ou encore lors de sélections avec des composés en développement comme les dérivés thiophènes.

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