Development of rolling circle amplification based biosensing
\ntechnologies

<br>Les maladies infectieuses sont l'une des principales causes de mortalité humaine et animale. La
\npropagation de maladies infectieuses parmi la faune et les animaux domestiques menace la
\nproduction animale, l'approvisionnement alimentaire et a également un impact sur la biodiversité
\nenvironnementale et mondiale. Les gouvernements dépensent beaucoup d’argent pour les soins
\nde santé publics et à ce titre, la surveillance des maladies peut avoir un rôle majeur pour la
\nprévention afin de réduire les risques pour la santé et aussi pour réduire les dépenses publiques
\nen santé. Un exemple actuel evident de l’importance d’un tel suivi est bien illustré par le
\ncoronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), responsable de la COVID-
\n19.</br> <br>
\nLa méthode standard pour la détection et l'identification des maladies infectieuses telles que le
\nvirus de la grippe et le coronavirus est la PCR quantitative (qPCR). La qPCR est une méthode de
\nlaboratoire qui nécessite un thermocycleur en temps-réel, qui est coûteux et sophistiqué, ainsi
\nque du personnel de laboratoire formé pour effectuer de tels tests. D'autres méthodes
\nalternatives, y compris le dosage immuno-enzymatique conventionnel (ELISA) et les méthodes
\nbasées sur la culture cellulaire, nécessitent également des laboratoires équipés pour effectuer
\nles tests. Par conséquent, le développement d'une méthode simple, sensible, portable, rapide et
\nsurtout sans instrumentation, pour la surveillance des maladies infectieuses sur le terrain est très
\nimportant pour le dépistage rapide des virus et la gestion de la situation en cas de pandémie.</br> <br>
\nL'amplification en cercle roulant (RCA) est une technique d'amplification d'ADN isotherme
\nbiomimétique et en raison de sa robustesse et de sa simplicité, elle peut rivaliser avec les autres
\nméthodes d'amplification isotherme de l'ADN, comme l'amplification isotherme à médiation en
\nboucle (LAMP). La RCA est une réaction de polymérisation d'ADN isotherme qui génère un ADN
\nsimple brin à partir d'une courte matrice d'ADN circulaire. Contrairement à la réaction en chaîne
\npar polymérase (PCR) qui nécessite un thermocycleur et une ADN polymérase thermostable, la
\ntechnique RCA est isotherme et la polymérisation se produit à une température plus basse (25-
\n65 ° C selon les enzymes choisies). La technique a d'abord été menée pour la détection ultrasensible
\nde cibles ADN et a aussi été combinée à toutes sortes de plates-formes pour la détection
\ntrès sensible des cibles diverses.</br> <br>
\nIci, plusieurs biocapteurs basés sur RCA ont été développés pour la détection de maladies
\ninfectieuses en utilisant différentes plates-formes, y compris des plates-formes colorimétriques et
\noptiques. En outre, une nouvelle méthode a été proposée pour la génération d'ADN linéaire et circulaire monocaténaire in vitro en raison des vastes applications dans le domaine de la biologie
\nmoléculaire, en particulier dans la procédure du SELEX (Systematic Evolution of Ligands by
\nEXponential enrichment). De plus, cette nouvelle technique est utilisée pour la sélection
\nd'aptamères linéaires et circulaires contre le coronavirus du Moyen-Orient (MERS CoV). Voici les
\nprincipaux objectifs de cette thèse: i) développer une nouvelle technologie colorimétrique basée
\nsur RCA pour la détection simple des maladies infectieuses en utilisant le rouge de phénol comme
\ncolorant sensible au pH. ii) Couplage de RCA avec d'autres plates-formes sensibles, y compris
\nla technologie de microcavité optique, comme nouveau moyen de détection sensible des
\nbiomarqueurs. iii) Développer une nouvelle technique de préparation in vitro d'ADN simple brin
\nlinéaire et circulaire (ADNsb). Dans le cadre de l'objectif iii, cette nouvelle technique a été utilisée
\npour la sélection d'aptamères linéaires et circulaires contre le MERS-CoV.</br> <br>
\nLe premier objectif de cette thèse, une méthode colorimétrique simple est développée pour la
\ndétection spécifique du virus de la grippe H5N1 en utilisant le rouge de phénol comme colorant
\nsensible au pH. Tout d'abord, suite à l’optimisation les paramètres expérimentaux, la performance
\nde la réaction de ligature dans une solution sans tampon (sans Tris-HCl), a été évaluée avec
\nsuccès, de même que sa sélectivité. Ces travaux ont été publiée dans le journal Talanta. Cette
\ntechnique conviviale a l’avantage d’être simple, portable et de ne requérir aucune instrumentation
\ndue à nature isotherme.</br> <br>
\nLe deuxième objectif a été réalisé en collaboration avec le laboratoire de photonique de
\nl'Université du Québec en Outaouais. Dans cette étude en couplant deux techniques puissantes,
\ny compris l'interféromètre de Mach Zehnder en ligne à microcavité optique (μIMZI), une
\nplateforme de détection ultra-sensible a été développée pour la surveillance en temps réel des
\nmaladies infectieuses et en particulier du virus de la grippe H5N1 (l'objet de cette étude). Ce
\nbiocapteur à base de uIMZI fournit une amplification d'ADN dans un volume aussi bas que le
\npicolitre où la réaction RCA est initiée à partir des amorces immobilisées dans la cavité. Cela a
\nconduit à la large plage linéaire de 283 et 2 830 000 copies cibles H5N1 et à une limite de
\ndétection (LOD) très basse de 6 copies. Ce travail est publié dans le journal Lab on a Chip.</br> <br>
\nDans le cas de l'objectif 3, une nouvelle méthode de préparation in vitro d'ADNsb linéaire et
\ncirculaire a été introduite. Bien qu'il existe plusieurs méthodes pour préparer l'ADNsb linéaire à
\npartir de produits, la production d'ADNsb circulaire est toujours un défi. Dans ce travail, en utilisant
\ndes modifications dérivées du phosphore, à savoir des liaisons phosphorothioate et des
\nmodifications de phosphorylation et en utilisant l'enzyme exonucléase Lamda conventionnelle, la
\npréparation d'ADNsb circulaire à partir d'un produit de PCR a été simplifiée. Cette méthode peut servir pour des applications telles que le SELEX ou la préparation de PLP basée sur PCR, la
\npréparation de bibliothèque pour séquençage, etc. Les résultats de ce travail seront soumis
\nprochainement pour un troisième article. De plus, pour vérifier les performances de la méthode
\nproposée, 15 cycles de SELEX ont été effectués pour la sélection des aptamères linéaires et
\ncirculaires par rapport au MERS CoV. </br> <br>One of the leading causes of human and animal death is infectious diseases. The propagation of
\ninfectious diseases among wildlife and domestic animals threatens animal production, food supply
\nand have impacts on the environmental and global biodiversity as well. Governments are
\nspending lots of money on the public healthcare and, in that regard, monitoring of diseases and
\npathogens can have a major role in prevention to reduce risks for health and decrease the
\ngovernments’ expenses on the public health-care. Also, viral infection of animal population
\nendangers the global public health by introduction of new versions of pandemic viral strain and
\nsporadic human zoonotic infections in view of the fact that animals are regarded to be the cause
\nof about 70% of all emerging infections. An obvious current example of the importance of such
\nmonitoring is illustrated by the pandemic of Severe Acute Respiratory Syndrome Corona Virus 2
\n(SARS-CoV-2).</br> <br>
\nThe gold standard method for detection and identification of infectious diseases such as influenza
\nvirus and coronavirus is quantitative PCR (qPCR). qPCR is a lab-based method and it needs an
\nexpensive and sophisticated real-time thermal cycler machine as well as trained lab staff
\nmembers to do such tests. Other alternative methods including conventional enzyme-linked
\nimmunosorbent assay (ELISA) and cell culture-based methods also lab need equipped labs to
\nperform the tests. Therefore, developing a simple, sensitive, portable, rapid and more importantly
\ninstrumentation-free method for in field infectious disease monitoring is very important for fast
\nscreening of the viruses and managing of the situation in case of pandemic.</br> <br>
\nRolling circle amplification (RCA) is a biomimetic isothermal DNA amplification technique and
\nbecause of its robustness and simplicity, it can compete with the other isothermal DNA
\namplification methods, like loop mediated isothermal amplification (LAMP). RCA is an isothermal
\nDNA polymerization reaction that generate single strand DNA from short circular DNA template.
\nIn contrast to PCR which needs thermal cycler and thermostable DNA polymerases, the RCA
\ntechnique is isothermal, and polymerization occurs at lower temperature (25-65˚C depending on
\nchosen enzymes). The technique was first conducted to ultra-sensitive detection of DNA targets
\nand also combined to all sorts of platform for highly sensitive detection of targets.</br> <br>
\nHerein, several RCA based biosensors have been developed for detection of infectious disease
\nusing different platforms including colorimetric and optical platforms. In addition, a novel method
\nwas proposed for in vitro single stranded linear and circular DNA generation due to the broad
\napplications in molecular biology field especially in SELEX procedure. Moreover, this novel technique is used for linear and circular aptamer selection against middle east corona virus
\n(MERS CoV). Here are the main objectives for this PhD thesis: i) developing a new

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