Développement et caractérisation de la gésifection comme méthode de livraison d'acides nucléiques dans les cellules de mammifères

La livraison d’acides nucléiques a révolutionné la recherche biomédicale depuis des décennies. Il existe de nombreuses manières de livrer des acides nucléiques dans des cellules de mammifères. Chaque méthode possède ses avantages et ses inconvénients. Parmi elles, celles dites hybrides, représentent une alternative très intéressante puisqu’elles résultent de la combinaison de méthodes de livraison traditionnelles pour en obtenir une nouvelle aux propriétés améliorées. Cette thèse se consacre à l’étude d’une de ces méthodes de livraison hybride appelée gésifection. Cette dernière consiste à combiner des nanovésicules biologiques appelées « gésicules » avec un agent chimique nommé bromure d’hexadiméthrine pour livrer des acides nucléiques dans des cellules de mammifères. Bien que cette méthode ait fait l’objet de peu de recherches, les résultats publiés jusqu’à présent apparaissent suffisamment intéressants pour poursuivre son développement et sa caractérisation. Cette thèse est divisée en quatre chapitres. Le chapitre 1, est dédié à la revue de la littérature. Il présente un tour d’horizon des méthodes de livraison d’acides nucléiques, puis une présentation des mécanismes impliqués dans la pénétration cellulaire, et enfin, un état des lieux concernant les travaux sur les gésicules. Les chapitres 2, 3 et 4, présentent les travaux expérimentaux réalisés dans le cadre de cette thèse. Le chapitre 2 est consacré au développement d’une méthode optimisée pour produire et utiliser les gésicules pour la livraison d’acides nucléiques. Les gésicules se sont révélées être des particules très résistantes puisque leur capacité de livraison a été maintenue après plusieurs semaines de conservation à différentes températures, ainsi qu’après plusieurs cycles de congélation décongélation. Par ailleurs, les expériences de gésifection ont démontré la capacité de cette méthode à livrer de l’ADN dans des cellules primaires (connues pour être réfractaires) mais également des acides ribonucléiques (ARN) et des plasmides de grandes tailles. Le chapitre 3 est consacré à des expériences de caractérisation des gésicules au niveau morphologique et de leur contenu protéique. Les gésicules ont été visualisées par microscopie électronique avec la confirmation de la présence de la protéine VSV-G à leur membrane. Enfin, une analyse par spectrométrie de masse a permis de fournir la première description du contenu protéique des gésicules. Cela a permis de faire apparaître toute la complexité de ces nanovésicules. Le dernier chapitre de cette thèse (chapitre 4) est dédié à l’identification des mécanismes de pénétration et de transport cellulaire impliqués dans la gésifection. Tout d’abord, une série d’expériences préliminaires a permis d’établir des conditions expérimentales garantissant la fiabilité des résultats (efficacité des lavages, efficacité et innocuité des inhibiteurs métaboliques). Les résultats ont démontré que les complexes de gésifection pénètrent dans les cellules HeLa par macropinocytose et endocytose dépendante des clathrines. Leur parcours intracellulaire jusqu’au noyau de la cellule implique quant à lui, les dynéines et les microtubules. En conclusion, cette thèse contribue significativement au développement de la méthode de gésifection en décrivant un procédé de production et d’utilisation efficaces, et en apportant une meilleure compréhension de la composition et du fonctionnement des gésicules pour livrer des acides nucléiques.

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