Understanding respiratory syncytial virus entry requirements by mapping the interaction between the viral fusion protein and the insulin-like growth factor-1 receptor

Human respiratory syncytial virus (RSV) is a global health threat with approximately 33 million people infected and approximately 120,000 deaths each year.Respiratory syncytial virus (RSV) has two main surface glycoproteins, the attachment glycoprotein (G) and the fusion (F) protein, which together mediate viral attachment and entry.Recent studies have revealed a new model for RSV entry.In this model, attachment is mediated by non-specific interactions between the RSV-G protein and glycosaminoglycans, and subsequently the RSV-F protein can interact specifically with the insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R).This interaction triggers IGF1R activation, culminating in the activation of PKCζ signaling and the recruitment of an additional RSV-F receptor, nucleolin, from the nucleus to the cell surface.At the cell surface, RSV-F, IGF1R, and nucleolin form a trimeric complex that triggers RSV fusion and completes the RSV entry process.However, the specific residues of IGF1R that are important for interactions with RSV-F are still unclear.As such, we performed molecular docking analyses and identified 35 residues in IGF1R that may be important for interactions with RSV-F.We used alanine scanning mutagenesis to generate 35 mutants of IGF1R and we assessed their expression, maturation, as well as the effect of each mutation on RSV entry.We identified several mutations that appear to inhibit IGF1R maturation, but surprisingly these mutations did not have significant effects on RSV entry.This suggests that IGF1R maturation may not be required for RSV entry.Additionally, we identified one residue, S788A, that significantly reduced RSV infection, revealing a potentially critical residue for RSV-F-mediated entry.Future studies will be needed to further explore cell surface localization of IGF1R alanine mutants and verify the importance of Ser788 in RSV entry.Finally, to develop IGF1R-based biological decoy receptors for RSV entry, we generated a mutant IGF1R library using sequence saturation mutagenesis, targeting the region of IGF1R identified by our III molecular docking analysis.In future, we plan to establish a directed evolution platform and flow cytometry-based screening assay to develop biological inhibitors of RSV entry.We anticipate that this research will help to map the RSV-F:IGF1R interaction interface, and will aid in the development of targeting strategies that inhibit RSV entry.We hope that the establishment of the directed evolution platform will lead to the development of novel biological inhibitors of RSV entry, and that this approach can be applied to the development of antivirals for a variety of virushost interactions.IV RÉSUMÉ Le virus respiratoire syncytial humain (VRS) est une menace pour la santé mondiale, avec environ 33 millions de personnes infectées et environ 120 000 décès chaque année.Le virus respiratoire syncytial (VRS) possède deux glycoprotéines de surface principales, la glycoprotéine d'attachement (G) et la protéine de fusion (F), qui ensemble assurent la médiation de l'attachement et de l'entrée du virus.Des études récentes ont révélé un nouveau modèle d'entrée du VRS.Dans ce modèle, l'attachement est facilité par des interactions non spécifiques entre la protéine G du VRS et les glycosaminoglycanes, puis la protéine F du VRS peut interagir spécifiquement avec le récepteur du facteur de croissance analogue à l'insuline de type 1 (IGF1R).Cette interaction déclenche l'activation de l'IGF1R, qui aboutit à l'activation de la signalisation de la PKCζ et au recrutement d'un autre récepteur du VRS-F, la nucléoline, du noyau vers la surface cellulaire.À la surface des cellules, le VRS-F, l'IGF1R et la nucléoline forment un complexe trimérique qui déclenche la fusion du VRS et complète le processus d'entrée du VRS.Cependant, les résidus spécifiques de l'IGF1R qui sont importants pour les interactions avec le VRS-F ne sont toujours pas clairs.Ainsi, nous avons réalisé des analyses de docking moléculaire et avons identifié 35 résidus dans l'IGF1R qui pourraient être importants pour les interactions avec le VRS-F.Nous avons utilisé la mutagenèse à balayage d'alanine afin de générer 35 mutants d'IGF1R et nous avons évalué leur expression, leur maturation, ainsi que l'effet de chaque mutation sur l'entrée du VRS.Nous avons identifié plusieurs mutations qui semblent inhiber la maturation de l'IGF1R, mais étonnamment, ces mutations n'ont pas eu d'effets significatifs sur l'entrée du RSV.Ceci suggère que la maturation de l'IGF1R n'est peut-être pas nécessaire pour l'entrée du VRS.De plus, nous avons identifié un résidu, le S788A, qui réduit significativement l'infection par le VRS, révélant ainsi un résidu potentiellement critique pour l'entrée médiée par le VRS-F.Des études futures V seront nécessaires pour explorer davantage la localisation à la surface cellulaire des mutants alanine d'IGF1R et pour vérifier l'importance du résidu Ser788 dans l'entrée du VRS.Enfin, pour développer des leurres biologiques basés sur l'IGF1R pour l'entrée du VRS, nous avons généré une librairie de mutants de l'IGF1R en utilisant la mutagenèse par saturation de séquence, ciblant la région de l'IGF1R identifiée par notre analyse de docking moléculaire.À l'avenir, nous prévoyons d'établir une plateforme d'évolution dirigée et un test de criblage basé sur la cytométrie en flux pour développer des inhibiteurs biologiques de l'entrée du VRS.Nous pensons que cette recherche aidera à schématiser l'interface d'interaction VRS-F:IGF1R, et qu'elle contribuera au développement de stratégies de ciblage qui inhibent l'entrée du VRS.Nous espérons que l'établissement de la plateforme d'évolution dirigée mènera au développement de nouveaux inhibiteurs biologiques de l'entrée du VRS et que cette approche sera appliquée au développement d'antiviraux pour une variété d'interactions virus-hôte.VI ACKNOWLEDGEMENTS First and foremost, I would like to thank my supervisor Dr. Selena Sagan.Thank you for showing me the amazing world of virology, first through your lectures, and then through taking me on in your lab.Your passion and love for science kept me motivated and curious during my degree.I will always be grateful for the guidance and mentorship you gave me, both inside and outside of the lab.Finally, thank you for fostering an amazing lab environment, your weekly homemade ice cream will be greatly missed.I am excited to see how the lab continues to grow along your new journey!A big thank you to my past and present lab mates.Thank you, Jasmin, Trisha, and Sophie, for always being happy to answer my questions or sit down and talk something out.Thank you, Carolina, for always being able to resolve my crises.Marylin, for being my bay mate and going through this journey

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