Découverte et caractérisation des ARN non codants régulateurs chez methylorubrum extorquens, une bactérie au potentiel biotechnologique

<br>Methylorubrum extorquens est une bactérie au potentiel biotechnologique capable de métaboliser le méthanol, une matière première bon marché qui peut être dérivée de déchets. C’est une méthylotrophe facultative et un organisme modèle pour étudier le métabolisme des C1. Malgré son importance d’un point de vue biotechnologique et en recherche fondamentale, les ARN non codants (ARNnc) de cette méthylotrophe sont peu connus.</br> <br>
\nLes petits ARN (small RNA; sRNAs) de 50 à 300 nucléotides jouent un rôle important dans une grande variété de processus cellulaires, agissant principalement par complémentarité de leur séquence avec leurs ARNm ciblés. Environ 550 familles distinctes de sRNA sont annotées dans un large éventail d’espèces bactériennes, mais ils sont plus nombreux dans les organismes modèles très étudiés par rapport au reste des bactéries séquencées, mettant l’accent sur le potentiel de découverte de nouveaux sRNAs. Par exemple, peu de sRNAs sont annotés dans le génome de M. extorquens et aucun n’a été confirmé expérimentalement auparavant. Dans cette étude, les sRNAs précédemment annotés BjrC1505, ffh et CC2171 ont été validés. De plus, l’analyse de données RNA-seq a permis d’établir une liste considérable de sRNAs potentiels, dont les candidats Methylo2624 et Methylo1969, spécifiques au Methylobacteriaceae.</br> <br>
\nLes ARNnc peuvent aussi agir en cis lorsqu’ils ont un impact sur l’expression de gènes avoisinants, comme c’est le cas pour les thermorégulateurs ou les riboswitches répondants respectivement à un changement de température ou à des métabolites. Les riboswitches sont constitués entre autres d’un domaine d’aptamère capable de lier un ligand, ce qui impacte l’expression du gène en aval par la formation d’une structure secondaire d’ARN, un peu à la manière d’un interrupteur. Les méthodes bioinformatiques actuelles pour leur découverte présentent diverses limitations, entre autres pour les organismes comme M. extorquens où le nombre de souches séquencées et les annotations génomiques sont limités. Nous avons développé une technique expérimentale appelée le SR-PAGE (Shifted Reverse-Polyacrylamide Gel Electrophoresis), une méthode qui tire avantage du changement de structure de la séquence après la liaison avec le ligand dans un gel de polyacrylamide natif. Nous avons d’abord optimisé et validé le SR-PAGE avec des ARN régulateurs connus. Nous avons ensuite démontré que le SR-PAGE pouvait être utilisé comme outil de sélection au sein d’un SELEX afin de sélectionner des riboswitches à affinité modifiés et/ou améliorés. La technique SR-PAGE permet d’effectuer un large criblage, car un grand nombre de molécules d’ARN de séquences différentes et plus d’un ligand peuvent être testés simultanément. Cette thèse met l’accent sur l’importance des ARNnc dans la régulation génétique, en prenant exemple sur une bactérie au potentiel biotechnologique, M. extorquens, dont les ARN régulateurs sont peut étudiés.</br> <br>Methylorubrum extorquens is a biotechnologically relevant bacterium capable of metabolizing methanol, a cheap feedstock that can be derived from waste. It is a facultative methylotroph and a model organism for studying C1 metabolism. Despite its importance from a biotechnological perspective and in fundamental research, little is known about the non-coding RNAs (ncRNAs) of this methylotroph.</br> <br>
\nSmall RNAs (sRNAs) between 50 and 300 nucleotides play an important role in a wide variety of cellular processes, acting by sequence complementarity with their targeted mRNAs. Approximately 550 distinct sRNA families are annotated in a wide range of bacterial species, but they are more prominent in highly studied model organisms compared to the rest of the sequenced bacteria, emphasizing the potential for discovery of new sRNAs. For example, few sRNAs are annotated in M. extorquens and none has ever been experimentally confirmed before. In this study, the previously annotated sRNAs BjrC1505, ffh and CC2171 were validated. In addition, analysis of RNA-seq data led to a considerable list of potential sRNAs, including candidate Methylo2624 and Methylo1969, specific to Methylobacteriaceae.</br> <br>
\nNon-coding RNAs can be cis-acting where they impact the expression of neighboring genes, as it is the case for thermoregulators or riboswitches responding to a change in temperatures or to metabolites respectively. Riboswitches consist of an aptamer domain capable of binding a ligand, which impacts the expression of the downstream gene by inducing a change in RNA secondary structure, somewhat like a switch. Current bioinformatics methods for their discovery have various limitations, especially for organisms like M. extorquens where the number of sequenced strains and genomic annotations are limited. We have developed an experimental technique called SR-PAGE (Shifted Reverse-Polyacrylamide Gel Electrophoresis), a method that takes advantage of the change in secondary structure upon binding of the ligand within a native polyacrylamide gel. We have optimized and validated SR-PAGE with known regulatory RNAs. We also demonstrated that SR-PAGE could be used as a selection tool within a SELEX to select for affinity modified and/or enhanced riboswitches. The SR-PAGE technique allows for broad screening, as numerous RNAs with different sequences and more than one ligand can be tested simultaneously. This thesis focuses on the importance of ncRNAs in gene regulation, using as an example a bacterium with biotechnological potential, M. extorquens, whose regulatory RNAs are not well characterized.</br>

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