Utilising DNA Modifying Enzymes for Method Development in Molecular Biology
Notice bibliographique
Résumé
Method development plays a critical role in advancing molecular biology by enabling the detection, visualization, and interpretation of complex cellular processes. This dissertation focused on the development and optimization of methods based on DNA modifying enzymes to investigate DNA damage and protein–protein interactions—key mechanisms in genomic integrity, stress response, and gene regulation. The first part of the work involved the development of Polymerase-Assisted DNA Damage Analysis (PADDA), a method combining the comet assay with enzymatic labelling to distinctively detect DNA single-strand breaks (SSBs) and double-strand breaks (DSBs) with fluorescence microscopy. For a genome-wide detection of SSBs, a novel sequencing-based method—Sequence-Templated Erroneous End-Labelling sequencing (STEEL-seq) was developed. The method is based on an engineered, artificial DNA polymerase, Sloppymerase. Its highly error-prone activity allows for DNA synthesis in absence of a specific nucleotide (e.g. dATP), creating unique patterns of mismatches directly downstream of an SSB. These mismatches can be detected after DNA sequencing analysis and give information about bona fide SSBs. The method was validated using multiple sequencing platforms, revealing enrichment of SSBs at promoter regions of actively transcribed genes. The final part of the work covers a new antibody-based proximity assay for the detection of endogenous protein-protein interactions - Enzyme-Activated Proximity of Oligonucleotides Sensing (EPOS). Across multiple cellular models, EPOS could produce robust results for the detection of PPIs with higher resolution, improved dynamic range and increased sensitivity compared with in situ proximity ligation assay. Collectively, the methods developed during this project demonstrate the transformative potential of enzymatic tools in molecular biology. By enabling more precise and accessible analysis of DNA damage and protein interactions, these approaches provide valuable platforms for future research in genomics, cell biology, and biomedical science.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,006 | 0,008 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,002 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,002 | 0,002 |
| Études des sciences et des technologies | 0,001 | 0,001 |
| Communication savante | 0,002 | 0,002 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,002 |
| Intégrité de la recherche | 0,002 | 0,004 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,006 | 0,011 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».