Construction d’un système de vecteur viral dérivé du SARS-CoV-2

L'émergence du Syndrome Respiratoire Aigu Sévère Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), le virus responsable de la COVID-19, a suscité des efforts considérables dans le développement de vaccins et de médicaments antiviraux.Bien que les vaccins actuels aient montré leur efficacité, ils présentent également certaines limitations.Le développement de médicaments antiviraux pour la COVID-19 est davantage complexifié par la classification du SARS-CoV-2 comme pathogène de niveau de biosécurité 3 et l'absence d'un système robuste permettant de mesurer précisément l'infection virale.Afin de relever ces défis, le programme de recherche présenté dans cette thèse vise à développer des outils alternatifs en utilisant des particules pseudo-virales (Virus-Like Particles, VLPs) et des systèmes d'ARN réplicons, avec l'objectif ultime de créer un vecteur viral entièrement basé sur le SARS-CoV-2.Des VLPs du SARS-CoV-2 ont été générées avec succès grâce à la co-expression des quatre protéines structurales essentielles -membrane (M), petite enveloppe (E), spicule (S) et nucléocapside (N) -dans des cellules de mammifères.La formation et la libération réussies de ces VLPs ont validé le rôle essentiel de ces protéines dans la production de VLPs, puisque l'élimination d'une ou deux de ces protéines structurales a entraîné une diminution de l'efficacité.En s'appuyant sur cette base, des vecteurs lentiviraux ont été utilisés pour établir des lignées cellulaires humaines stables capables de produire des VLPs.Ces VLPs, en se liant aux récepteurs naturels du virus et en facilitant l'entrée cellulaire et la présentation d'antigènes, présentent un potentiel significatif pour le développement de candidats vaccins intranasaux innovants.Parallèlement, cette étude a exploré l'expression d'ARN réplicon du SARS-CoV-2 à partir de l'ADN et le rôle de la protéine N dans l'amélioration de la réplication de l'ARN.En introduisant un chromosome artificiel bactérien (BAC) codant un réplicon du SARS-CoV-2 sous un promoteur T7 dans des cellules HEK293T modifiées pour exprimer l'ARN polymérase T7, une expression faible mais constante de la protéine rapporteuse a été observée.De manière inattendue, cette expression dépendait de la linéarisation préalable de l'ADN BAC avant la transfection, mais elle était indépendante de l'ARN polymérase T7 et résistante au remdésivir, révélant l'absence d'autoréplication de l'ARN réplicon.En résumé, nous avons pas réussi à établir un système d'expression de réplicon ADN initié par une polymérase T7, mais nous avons fait des découvertes intéressantes sur l'expression atypique des gènes du réplicon.Malgré la disponibilité de divers systèmes vecteurs pour étudier l'infection et la réplication du SARS-CoV-2, beaucoup sont limités par leur incapacité à simuler complètement les étapes postérieures à l'entrée ou par la complexité des protocoles de transfection multi-plasmidiques.Pour surmonter ces limitations, nous avons développé un nouveau vecteur viral du SARS-CoV-2.Ce vecteur inclut les quatre protéines structurales exprimées de manière stable par transduction lentivirale, associées à l'électroporation d'un ARN réplicon codant une protéine fusion luciférase-GFP.Concentré par ultracentrifugation, ce vecteur a infecté avec succès des lignées cellulaires humaines exprimant les récepteurs ACE2 et TMPRSS2, comme l'ont démontré l'activité détectable de la luciférase et la fluorescence GFP.La sensibilité du vecteur au remdésivir et aux interférons de type I souligne son potentiel pour le criblage de médicaments antiviraux.Bien qu'une amélioration des titres viraux soit nécessaire, ce système représente un outil prometteur pour les études de virologie moléculaire du SARS-CoV-2.En conclusion, ces études apportent des contributions substantielles à la recherche sur le SARS-CoV-2 en établissant une plateforme innovante basée sur des cellules de mammifères pour la production de VLPs, qui présentent un potentiel significatif pour le développement de vaccins et les études d'expression génique.De plus, le système de vecteurs viraux introduit ici offre des opportunités précieuses pour faire progresser le développement de vaccins, améliorer le criblage de médicaments antiviraux et approfondir notre compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à l'infection par le SARS-CoV-2.

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