Biophysical Techniques and Assay Design for the Development of Small Molecule Inhibitors
Notice bibliographique
Résumé
One of the most important pillars in preclinical research involves the biophysical characterization of protein-compound interactions. This characterization, describing the in vitro potency and binding properties of the interaction, is measured through techniques such as fluorescence polarization assays, thermal shift assays, isothermal titration calorimetry experiments, and activity-based assays. A broad biophysical profile of each compound against the target of interest allows for fine-tuning of the molecule through structure-activity relationship-guided design. Biophysical profiling can enable accurate prediction of the interaction within a biological setting and thus provide insight into the mechanism-of-action observed in a cellular setting. This thesis details the recombinant protein expression and purification as well as the biophysical assay development of several attractive therapeutic targets for cancer treatment including STAT3, STAT5B, UBA5, HDAC6, and HDAC8. To aid in STAT inhibitor discovery, exploration of assay development to confirm STAT-phosphorylation inhibition was described. This thesis reports a rapid fluorescence-based screening method to identify SH2 domain binders followed by a phosphorylation-inhibition assay to validate mechanism of action for molecules determined from the high-throughput screening assay. Additionally, the development and optimization of a fluorescence polarization (FP) assay for binding affinity determination of DNA binding domain inhibitors for STAT3 was also described. Similarly, FP assays and thermal shift assays were also validated for drug discovery program geared towards identification of highly selective and potent HDAC6 and HDAC8 inhibitors. Fluorescence-based activity assays and in cellulo nanoBRET assays were also established for HDAC proteins to confirm the results obtained from preliminary biophysical assays. Exploration of high-throughput virtual screening was also employed to identify novel UBA5 inhibitor scaffolds from a diverse natural product and natural product derivative libraries. This experiment yielded a lead candidate with potential for refinement through structure-activity relationship (SAR) to improve drug-like qualities of the molecule. Lastly, the hijacking of the upregulated prenylation pathway in cancer for artificial protein-membrane anchorage was investigated for utility as an alternative protein inhibition mechanism. Collectively, these studies demonstrate the progress in the assay development area for the targeting of multiple proteins to aid the drug discovery process.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,005 | 0,004 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,002 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,002 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,001 | 0,001 |
| Communication savante | 0,002 | 0,002 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,004 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,003 | 0,004 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».