Designing Light Controlled Protein-protein Interactions using Photoactive Yellow Protein and Yeast-two Hybrid Screening
Notice bibliographique
Résumé
Molecular tools that control biological systems provide new avenues to explore and answer fundamental biological questions, leading to new biomedical and industrial applications. The pursuit of greater spatial-temporal control has given rise to the field of optogenetics, which uses light to manipulate biological systems. While a broad suite of optogenetic tools has been developed, many of them require further optimization. There is a need to develop high-throughput screening platforms to facilitate this optimization. Furthermore, there remain many valuable biological targets yet to be adapted to optogenetic control. To address these needs, this thesis explores the use of yeast two hybrid (Y2H) technology as a high-throughput screening platform for both improving and developing new optogenetic tools. I also describe, two new optogenetic tools that were developed as photoswitchable affinity reagents.We began by developing a Y2H based selection and screening system to screen for photoswitchable protein-protein interactions (Chapter 2). Using Y2H we found that we were able to improve an existing optogenetic tool that undergoes blue light-mediated dissociation. Furthermore, we found that Y2H results were generally reflective of protein behaviour both in vitro and in mammalian cells. We then used Y2H to develop a genetically encoded photoswitchable affinity reagent by evolving the photoswitchable protein photoactive yellow protein (PYP) to bind the fluorescent protein mVenus (Chapter 3). This may serve as a general method for creating optogenetic tools as PYP could be evolved to bind other target proteins in a light dependent manner. Finally, in addition to making PYP based affinity reagents, I present an alternative strategy to photoswitchable affinity reagent design, utilizing the phenomena of mutually exclusive folding (Chapter 4). To this end PYP was inserted into a 3-helix bundle affinity reagent known as an affibody to create a chimera designated Z-PYP, which was found to make light-controlled protein-protein interactions. This alternative design strategy is potentially more efficient, as existing affinity reagents tools can be made photoswitchable via the insertion of PYP. This work pioneers new engineering methods for optogenetic tool development and creates several novel optogenetic tools to control and manipulate biology.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,001 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».