Fabrication and Surface Modification of Poly L-Lactic Acid Nanostructures for Growth Factor Immobilization and Neural Stem Cell Delivery

Les accidents vasculaires cerebraux, le cancer et la maladie d’alzheimer sont les principales causes de deces au Canada. Les lesions nerveuses ou les nerfs endommages dans le systeme nerveux central peuvent detruire la qualite de vie des survivants, presentent de grands couts pour la societe et peuvent entrainer la mort. Il n’existe actuellement aucun traitement efficace encore pour aider a la regeneration des tissus nerveux. Les strategies de regeneration des tissus nerveux ont ete etudiees, cependant, de nombreuses limites ont ete rencontrees. Par exemple, l'injection directe de cellules souches neuronales dans le systeme nerveux central a donne lieu a la formation de tumeurs. L'injection directe de facteurs de croissance n’a revele aucun benefice avant sept jours de traitement continu. En outre, l'encapsulation des facteurs de croissance a ete precedemment etudiee et possede des inconvenients majeurs. Des limites telles que, la difficulte a maintenir leur livraison a long terme sur une gamme de concentration definie, leur courte demi-vie ainsi qu’une courte distance de migration ont ete observees. La production in situ et la distribution de facteur de croissance par l’intermediaire de cellules telles que les fibroblastes modifies genetiquement pour exprimer le BDNF ainsi que les cellules fabriquees en coculture ont aussi demontre des inconvenients majeurs. En effet l’immunosuppression etait constamment requise et le taux de survie des cellules tres faible. Les biomateriaux tels que les hydrogels ont ete largement etudies et presentent des difficultes de manipulations, une faible adherence, des couts eleves, des difficultes a incorporer des medicaments sur leur structure ainsi que de presenter des difficultes lors de leurs sterilisations. Cette etude vise donc a optimiser les strategies de regeneration des tissus nerveux existants. Les biomateriaux electrofiles ont montre des resultats prometteurs dans la litterature en raison de leur porosite, haut rapport surface-volume, interconnexion des pores ainsi que de leur topographie imitant la matrice extracellulaire (ECM) du cerveau. Ces biomateriaux electrofiles v ont donc ete utilises dans ce projet. Le procede d'electrofilage a ete utilise dans cette etude afin d'obtenir des fibres dans la gamme nanometrique presentant une topologie a haute porosite, le diametre des fibres ideales ainsi qu’une resistance mecanique adequate. L’acide poly lactique-L (PLLA) est etudie dans cette recherche; il s'agit d'un polymere couramment utilise dans l'ingenierie tissulaire neurale etant donne qu'il est autorise par la FDA et a ete utilise sous la forme de nanofibres electrofilees. Des etudes anterieures ont utilise d'autres proteines pour l'immobilisation tels que la laminine et le collagene. Ces resultats, cependant, n'etaient pas prometteurs et necessitaient l'addition de facteurs de croissance dans les medias. Par consequent, dans ce travail, les nanofibres de PLLA electrofilees ont ete optimisees par greffage de maniere covalente du facteur de croissance epidermique (EGF) puisque EGF a montre des resultats prometteurs dans des etudes precedentes. Les nanofibres de PLLA electrofilees ont d'abord ete fonctionnalisees avec polyallylamine pour introduire des groupes amine. Ensuite, le greffage de l'EGF par l'intermediaire d'un ester de glycol de bis-N-succinimidyle pentaethylene (PEG) espaceur est effectue. Le substrat est reste physiquement intact et le diametre moyen de fibres ainsi que la porosite est restes inchanges apres la fonctionnalisation de groupes d’amine. Ceci est en contraste frappant avec les protocoles d'amination se fondant sur un traitement au plasma qui a rapporte une degradation du PLLA ou aminolyse au moyen de la petite molecule ethlynediamine (EtDA). Des cellules souches d’ingenerie ressemblant a des cellules souches neuronales (NSLC) ont ensuite ete ensemencees sur les substrats modifies et se sont averees viables jusqu'a 14 jours. Leur proliferation ainsi que leur propagation ont ete observees. L'adherence cellulaire et la proliferation sont superieures lorsque les substrats ont ete greffes avec de l'EGF en comparaison a des substrats qui ont ete seulement amines. Comme temoin positif, la proliferation des NSLC a ete caracterisee sur des nanofibres de laminine dans du milieu depourvu de EGF. Aucune difference significative dans la proliferation des cellules entre les substrats de type EGF greffe et le temoin positif n’a ete observee. Par consequent, ce nouveau biomateriau fonctionnalise et vi greffe du EGF demontre une adhesion cellulaire efficace, une proliferation ainsi que la viabilite des cellules jusqu'a 14 jours et presente une avenue prometteuse dans le traitement de la regeneration de cellules souches. ---------- Damaged nerves and nerve injuries in the Central Nervous System (CNS) diminish the quality of life of survivors, are costly to society, and can cause death. Strokes, cancer, and Alzheimer’s Disease (AD) are the leading causes of death in Canada. There is currently still no efficient treatment to aid in the neural tissue regeneration of damaged nerve cells. Previous nervous tissue regeneration strategies have been studied, however, many limitations were encountered. For example, direct injection of neural stem cells into the central nervous system (CNS) has resulted in tumor formation. Direct injection of growth factors showed no benefits until after seven days of continuous treatments. Furthermore, the encapsulation of growth factors was previously studied and demonstrated major drawbacks. Some limitations, such as the difficulty to maintain long-term delivery within a defined concentration range, as well as the short half-life of the growth factors and short migration distance were observed. Additionally, the in situ production and delivery of growth factors using cells, such as the transplantation of genetically modified fibroblasts to express BDNF, as well as the co-culturing of cells have also seen some drawbacks. Immune suppression was constantly needed and low cell survival rate was observed. Furthermore, biomaterials such as hydrogels have been widely studied and proved to be difficult to handle and sterilize, load drugs and nutrients, are nonadherent, and expensive. This study thus aims at optimizing existing nervous tissue regeneration strategies. Electrospun biomaterials have shown promising results in literature due to its high porosity, high surface area-to-volume ratio, interconnected pores, and topography that mimic extra cellular matrix (ECM) in the brain. The electrospinning process was used in this study to obtain the desired qualities mentioned, as well as to obtain fibers in the nano-metric range. Poly L-lactic acid (PLLA) is a polymer commonly used in neural tissue engineering, since it is FDA-approved and was used as a form of electrospun nanofibers in this study. Previous studies have used other proteins for immobilization such as laminin and collagen. These results, however, were not promising and most often required the addition of growth factors in the media as well. Therefore, in this work, the electrospun PLLA nanofibers were optimized by covalently grafting epidermal growth factor (EGF) since EGF has shown promising results in previous studies. viii The electrospun PLLA nanofibers were first functionalized with polyallylamine to introduce amine groups, before EGF grafting via a bis-N-succinimidyl-pentaethylene glycol ester (PEG) linker. The substrate remained physically intact, the average fiber diameter (AFD) and porosity also remained unchanged following amine functionalization. This is in stark contrast with amination protocols relying on plasma treatment that has been reported to degrade PLLA or aminolysis using the small molecule ethylenediamine (EtDa). Engineered neural stem-like cells (NSLC) were then seeded onto the modified substrates and were shown to be viable up to 14 days, while proliferating and spreading. Cell adhesion and proliferation was improved when substrates were grafted with EGF, when compared to substrates that were only aminated. As a positive control, NSLC proliferation was also characterized on laminin-coated mats in EGF-free medium where no significant differences in cell proliferation were observed between the EGF-grafted substrates and the positive control. Therefore, this new functionalized and EGF-grafted biomaterial has achieved efficient cell adhesion, proliferation as well as cell viability for up to 14 days and has promising use in stem cell regeneration therapy

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