Characterizing RNF20 and RNF40 in the Class Switching of B Cells¹

As a natural defense mechanism of the immune system, a group of white blood cells known as B cells produce antibodies to neutralize and clear pathogens and toxins from circulation. In order to increase the antibody binding strength, B cells undergo two types of genomic alterations: somatic hypermutation and class switch recombination (CSR). CSR is accomplished by the B cell-specific activation-induced cytidine deaminase protein (AID) which allows activated B cells to produce antibodies of different isotypes, which have distinct effector functions. Current research concerning the nature of antibody diversification examines the role of specific proteins in the CSR process. To test the role of these genes in CSR, I cloned the cDNAs of these genes. Through polymerase chain reaction (PCR) and PCR clean-up, the PCR products were ligated into an expression vector that harbours a drug-resistant gene. A variety of primers including RNF20 ’UTR, RNF40 ‘UTR, RNF40 clone and RNF40 clone targeted cDNA samples through gradient PCR. Although electrophoresis analyses show inconsistency with PCR products, conclusions can be drawn about the efficiency of primers, Phusion, and cDNA samples. Successful PCR products will be expressed in the CH12F3-2 B cell line that undergoes CSR at high rates and assess whether the CSR process is affected. I will also knockdown RNF20 and RNF40 by siRNA. If the hypothesis is correct, RNF20 and RNF40 will be discovered to be critical factors in the CSR process in B cells, and therefore in establishing an effective antibody response that is critical in protective immunity. En tant qu’un mécanisme de défense naturel du système immunitaire, un groupe de globules blancs appelés lymphocytes B produisent des anticorps afin de neutraliser et éliminer les agents pathogènes et les toxines de la circulation. Afin d’augmenter la force de liaison des anticorps, les cellules B subissent deux types d’altérations génomiques: une hypermutation somatique et une commutation de classe des entreprises (RSE). La RSE se réalise grâce à l’activation induite des protéines cytidine désaminase (AID) spécifique aux cellules B, qui permet aux cellules B activées de produire des anticorps de différents isotypes détenant des fonctions effectrices différentes. La recherche actuelle concernant la nature diversifiée d’anticorps examine le rôle de protéines spécifiques dans le processus RSE. Afin de tester le rôle de ces gènes dans RSE, j’ai cloné l’ADNc dans ces gènes. Par réaction en chaîne par polymérase (PCR) et la purification PCR, les produits obtenus par PCR ont subi une ligature dans un vecteur d’expression qui abrite un gène résistant aux médicaments. Une variété d'amorces don RNF20 ’UTR, RNF40‘UTR, le clone RNF40 et le clone RNF40 ciblaient des échantillons d’ADNc par un gradient PCR. Bien que les analyses d'électrophorèse montrent une certaine incompatibilité avec les produits de la PCR, certaines conclusions au sujet de l’efficacité des échantillons d’amorces, de Physion et de l’ADNc peuvent en être tirées. Les produits de la PCR retenus seront exprimés dans la lignée cellulaire CH12F3-2 B qui subit la RSE à des taux élevés pour ensuite évaluer si la démarche RSE est affectée. Je vais aussi effectuer un choc sur les gènes RNF20 et RNF40 par ARNsi. Si l'hypothèse est juste, le RNF20 et RNF40 seront identifiés en tant que facteurs critiques dans le processus RSE dans les cellules B, et donc critiques dans l’établissement d’une réponse d’anticorps efficace de l'immunité protectrice.

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