Études cinétiques de la [gamma]-glutamyltranspeptidase purifiée de reins de rat et recombinante humaine provenant des levures Pichia pastoris
Bibliographic record
Abstract
L'auteur a autorisé l'Université de Montréal à reproduite et diffuser, en totalité ou en partie, par quelque moyen que ce soit et sur quelque support que ce soit, et exclusivement à des fins non lucratives d'enseignement et de recherche, des copies de ce mémoire ou de cette thèse.L'auteur et les coauteurs le cas échéant conservent la propriété du droit d'auteur et des droits moraux qui protègent ce document.Ni la thèse ou le mémoire, ni des extraits substantiels de ce document, ne doivent être imprimés ou autrement reproduits sans l'autorisation de l'auteur.Afin de se conformer à la Loi canadienne sur la protection des renseignements personnels, quelques formulaires secondaires, coordonnées ou signatures intégrées au texte ont pu être enlevés de ce document.Bien que cela ait pu affecter la pagination, il n'y a aucun contenu manquant. NOTICEThe author of this thesis or dissertation has granted a nonexciusive license allowing Université de Montréal to reproduce and publish the document, in part or in whole, and in any format, solely for noncommercial educational and research purposes.Ensuite, l'étude de l'étape de désacylation par aminolyse, très peu étudiée dans la littérature, a été effectuée.Des substrats accepteurs dérivés de la L-méthionine possédant divers pKa au niveau du groupement cL-ammonium ont été synthétisés et caractérisés.Ils ont été utilisés dans des études cinétiques avec le D-y-glutamyl-p-nitroanilide comme substrat donneur.Un graphique de type Brønsted a été obtenu et a indiqué qu'une charge partiellement positive est développée à l'état de transition de l'étape limitante.De plus, des études de pH et d'effet isotopique de solvant ont montré qu'un proton était en vol à l'état de transition.Celui-ci a été attribué à une base générale nécessaire à la déprotonation du substrat accepteur.L'étape limitante dans la désacylation par aminolyse a été proposée comme étant l'attaque nucléophile du substrat accepteur sur l'intermédiaire acyl-enzyme concertée avec la déprotonation du substrat.Ce mécanisme permet également de comprendre la faible réactivité d'autres classes de composés comme substrat accepteur et de proposer que la transpeptidation catalysée par la GGT est plus importante que l'hydrolyse au niveau physiologique.Enfin, peu de systèmes efficaces d'expression de GGT recombinante permettant de faire de la mutagénèse dirigée et d'obtenir de l'enzyme en grande quantité existent.Un système d'expression de GGT humaine recombinante exempte dancre transmembranaire et liée à une séquence de six histidines ( Ris-tag ») a été mis au point.Ceci a nécessité la fabrication d'un plasmide contenant le gène de la GGT humaine modifiée, un facteur de sécrétion et le « lis-tag ».Ce plasmide a ensuite été transformé dans des levures P. pastoris.La GGT sécrétée dans le milieu de culture a été exprimée efficacement et purifiée par précipitation au sulfate d'ammonium et chromatographie d'affinité grâce au « Ris-tag ».Les caractéristiques de cette GOY sont très similaires à celles de l'enzyme purifiée à partir d'organes.Ce système d'expression s'avère meilleur que ceux existant déjà et sera utile pour étudier en détail le mécanisme de la GGT et son importance au niveau physiologique.
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How this classification was reachedexpand
Full frame machine prediction
Teacher imitationNot calibrated prevalence, not ground truth. Human validation pending. The Gemma side is a direct model label for every work in the frame, read from the title-only record. The Codex side is a classifier learned from the 10,348 direct Codex labels and calibrated to design-weighted sample rates; fields without enough sample support carry no Codex call. Candidate is the union of the two sides; consensus is their intersection. These outputs are machine_predicted_unvalidated and are not human labels.
Distilled classifier scores by category (both heads)
| Category | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Metaresearch | 0.001 | 0.000 |
| Meta-epidemiology (narrow) | 0.001 | 0.000 |
| Meta-epidemiology (broad) | 0.001 | 0.001 |
| Bibliometrics | 0.000 | 0.000 |
| Science and technology studies | 0.000 | 0.001 |
| Scholarly communication | 0.001 | 0.001 |
| Open science | 0.000 | 0.000 |
| Research integrity | 0.001 | 0.001 |
| Insufficient payload (model declined to judge) | 0.001 | 0.001 |
Machine scores (provisional)
The two teacher heads of the student model, read on this work. A score orders the frame for review; it never asserts a category, and the validation status ships verbatim with every row.
Baseline scores from an immature model (maturity gate not passed, 7 training rounds). Scores rank; they never assert a category.
score_only:v0-immature-baseline · verbatim from the scoring run: score_only means the number may rank works, and no category label ships from itClassification
machine, unvalidatedMachine predicted; a candidate call from one source (direct Gemma or distilled Codex), not a consensus.
How this classification was reached, model by model and score by score, is at the end of the page under "How this classification was reached".